siRNA靶向干扰GPC3基因慢病毒载体的构建及其对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响-论文.pdf

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1、·68·．中垡临康瞑师杂恚f电子版)2014年8月第8第l6期Ch’mJCliniciansrEkctronicF_Aition)．Au~rust15。2014．vo】．8．No．16●基础论著●siRNA靶向干扰GPC3基因慢病毒载体的构建及其对肝癌Huh一7细胞凋亡的影响雷长江龙浩成李磊姚春曾诚郑刚【摘要】目的构建GPC3基因短发夹干扰RNA(shR．NA)慢病毒载体，观察GPC3基因对人肝癌细胞系Huh．7凋亡的影响，探讨GPC3基因影响肝癌细胞生长的机制，为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法采

2、用RNA干扰技术转染肝癌细胞系Huh7，荧光定量PCR检测GPC3基因在多种肝癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向GPC3基因的小干扰RNA序列PGC．shRNA．GPC3，以脂质体(1ipofectamineTM2000)为载体转染人肝癌细胞系，筛选并建立稳定表达siRNA的细胞株。采用RT-PCR及Westernblot检测GPC3siRNA转染后mRNA表达情况，验证siRNA的干扰效率。流式细胞仪检测阴性对照组、未转染组和转染组细胞凋亡的情况。结果在肝癌细胞株Huh．7中，GPC3基因显示高表

3、达。测序验证PGC．shR．NA-GPC3重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入肝癌细胞株Huh．7后能明显抑制GPC3mRNA表达水平；同时，流式细胞仪检测发现，GPC3表达下调后，诱导Huh7细胞的凋亡。结论靶向GPC3的siRNA能有效抑制GPC3的表达，并能促进肝癌Huh7细胞凋亡。【关键词】RNA干扰；GPC3基因；慢病毒载体；肝癌细胞株EstablishmentofstableinterferencesiRNAtargetingGPC3geneanditsefectsontheapopt

4、osisofhepatocellularcarcinomacellfineHuh．7fChangltang’,LongHaocheng,LiLei,YaoChun．ZengCheng,ZhengGang．*DepartmentofGeneralSurgery,theSecondAfiliatedHospitalofJianghanUniversity,Wuhan430050,ChinaCorrespondingauthor：YaoChun,Email：changfiangOll8@163．corn[

5、Abstract]ObjectiveToconstructshorthairpininterferingRNA(shRNA)ofGPC3gene，toobservetheefectsofGPC3geneonhumanhepatomacelllineHuh一7apoptosisandtoinvestigatetheGPC3genemechanismforthegenetherapyofhepatocellularcarcinoma．MethodsRNAinterfefencetechnologywas

6、usedtotransfecthepatomacelllineHuh一7，theexpressionsofPCRGPC3geneoflivercancerweredetected．ConstructionofrecombinantGPC3genetargetingsmallinterferingRNAsequencePGC．shRN．GPC3，toliposomes(1ipofectamineTM2000)forthevector-transfectedhumanhepatomaeel1liness

7、tablyexpressingsiR．NAscreeningandestablishedcelllines．RT-PCRandWesternblotwasusedtoanalyzetheGPC3siRNAmR：NAexpressionsaftertransfectionandverifytheeficiencyofsiRNAinterference．Thecellsweredividedintothreegroups：negativecontrolgroup，nottransfeetiongroup

8、，andtransfectiongroup．Celapoptosisabilityofchangewasdetectedbytheflowcytometry．ResultsInthehepatomacelllineHUh一7medium，GPC3geneshowedhighexpression．SequencingPGC-shRNA-GPC3recombinantplasmidwasconstructedsuccessfully．Therecombinantplasm