smoothened慢病毒干扰载体的构建及其对人牙周膜干细胞增殖与分化的影响

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1、第３５卷第１１期第三军医大学学报Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１１２０１３年６月１５日ＪＴｈｉｒｄＭｉｌＭｅｄＵｎｉｖＪｕｎ．１５２０１３１１３３文章编号：１０００５４０４（２０１３）１１１１３３０４论著Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ慢病毒干扰载体的构建及其对人牙周膜干细胞增殖与分化的影响１２３１，４１５５１１张洁，常慧君，李雨轩，舒绍兵，罗金英，徐志玲，汤玲，杨彦春，周继祥（４０００３８重庆，第三军医大学１２３西南医院口腔科；６１００４１成都，四川省军区门诊部口腔科；６１８０００四川德阳，德阳市第二人民医院口腔科；４０１

2、１４７重庆，武警重４５庆总队机关门诊部口腔科；４０００４４重庆，重庆大学生物医学工程学院）［摘要］目的体外构建及筛选人Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）基因的慢病毒干扰载体，使用此载体下调人牙周膜干细胞（ｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＰＤＬＳＣｓ）中ＳＭＯ基因表达并检测其对细胞增殖与分化的影响。方法针对人ＳＭＯ基因设计３条干扰序列，构建ＲＮＡ干扰慢病毒载体，在２９３ＦＴ细胞中包装病毒液并转染２９３Ａ细胞，通过实时荧光定量ＰＣＲ检测干扰效率，得到具有最佳干扰效率的病毒后，转染Ｐ

3、ＤＬＳＣｓ，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测其对ＰＤＬＳＣｓ中ＳＭＯ基因的干扰效果及对细胞分化的影响，ＣＣＫ８法检测其对ＰＤＬＳＣｓ增殖的影响。结果成功构建３个ＳＭＯ慢病毒干扰载体（ｐＧＰＳＭＯ１、ｐＧＰＳＭＯ２、ｐＧＰＳＭＯ３），通过转染２９３Ａ细胞并进行实时荧光定量ＰＣＲ检测后，得到ｐＧＰＳＭＯ１具有最佳干扰效率，转染后ＳＭＯｍＲＮＡ水平下降到对照的（２８．５±２．５）％。利用此病毒能够很好地转染体外培养的ＰＤＬＳＣｓ，并使ＰＤＬＳＣｓ中ＳＭＯ蛋白水平下降８０％。进一步检测细胞增殖发现，与未转染组比

4、较，ＳＭＯ下调后ＰＤＬＳＣｓ增殖变慢［（１．０９±０２０）ｖｓ（１．８６±０．２１），Ｐ＜００１］。同时也导致成骨分化标志物Ｒｕｎｘ２的蛋白表达下调。结论利用慢病毒介导的干扰病毒载体成功干扰了ＰＤＬＳＣｓＳＭＯ基因的表达，ＳＭＯ基因的下调会导致ＰＤＬＳＣｓ增殖减慢，成骨分化能力减弱。［关键词］Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ；ＲＮＡ干扰；慢病毒；人牙周膜干细胞［中图法分类号］Ｒ３２２．４１；Ｒ３２９．２８；Ｒ３９４３３［文献标志码］ＡＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｌｅｎｔｉｖｉｒａｌＲＮＡｉｖｅｃｔｏｒｓｃｏｎｔａｉ

5、ｎｉｎｇｈｕｍａｎｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄｇｅｎｅａｎｄｉｔｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ１２３１，４１５５１ＺｈａｎｇＪｉｅ，ＣｈａｎｇＨｕｉｊｕｎ，ＬｉＹｕｘｕａｎ，ＳｈｕＳｈａｏｂｉｎｇ，ＬｕｏＪｉｎｙｉｎｇ，ＸｕＺｈｉｌｉｎｇ，ＴａｎｇＬｉｎｇ，ＹａｎｇＹａｎｃｈｕｎ，１１２ＺｈｏｕＪｉｘｉａｎｇ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＨｏ

6、ｓｐｉｔａｌ，ＴｈｉｒｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，４０００３８；Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ３Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，ＯｕｔｐａｔｉｅｎｔＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＳｉｃｈｕａｎＭｉｌｉｔａｒｙＣｏｍｍａｎｄ，Ｃｈｅｎｇｄｕ，ＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，６１００４１；ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，４ＤｅｙａｎｇＳｅｃｏｎｄＰｅｏｐｌｅ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｄｅｙａｎｇ，ＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，６１８０００；ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＳｔｏｍ

7、ａｔｏｌｏｇｙ，ＡｕｔｈｏｒｉｔｙＣｌｉｎｉｃｏｆＣｈｏｎｇｑｉｎｇＡｒｍｅｄ５ＰｏｌｉｃｅＦｏｒｃｅ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，４０１１４７；ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，４０００４４，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｏｆｈｕｍａｎｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）ｇｅｎｅｗｈｉｃｈｃａｎｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅＳＭＯｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ

8、ｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＰＤＬＳＣｓ）．ＭｅｔｈｏｄｓＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｈｕｍａｎＳＭＯｇｅｎｅ，３ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏｂｕｉｌｄＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ．Ａｌｌｔｈｅ３ｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｐａｃｋａｇｅｄｉｎ２９３ＦＴｃｅｌｌｓ，ａｎｄｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅ