MiR-9慢病毒载体构建及其对肺腺癌细胞顺铂耐药及增殖影响的研究

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1、暨南大学硕士学位论文MiR-9慢病毒载体构建及其对肺腺癌细胞顺铂耐药及增殖影响的研究ConstructionoflentivirusvectoraboutmiR-9anditseffectoncisplatin-resistanceandproliferationoflungadenocarcinomacellline作者姓名：全强指导教师姓名及学位、职称：徐萌（主任医师、教授）学科、专业名称：肿瘤学学位类型：专业学位论文提交日期：论文答辩日期：答辩委员会主席：论文评阅人：万方数据暨南大学硕士学位

2、论文万方数据暨南大学硕士学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件

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4、目的基因调节肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及耐药等生物学功能。通过华大基因测序肺腺癌细胞A549顺铂敏感株及耐药株老鼠移植瘤组织，结果发现miR-9-5p在A549/DDP(顺铂耐药株)组织中表达较A549细胞中低，TGFBR2基因在A549/DDP(顺铂耐药株)组织中高表达。查阅生物信息学网站预测：TGFBR2为microR-9-5p的靶基因，而miR-9-1是miR-9-5p的重要编码基因。为验证miR-9-5p靶向调节TGFBR2基因表达并探索miR-9-5p对肺腺癌A549及A549/DDP细

5、胞顺铂耐药、增殖的影响，构建含miR-9-1基因过表达miR-9-5P的载体及敲低miR-9-5p的海绵，并包装慢病毒，以便后续试验研究。方法：采用实时荧光定量PCR(fluorescentquantitativereal-timepcr，qRT-PCR)验证miR-9-5p、TGFBR2在A549和A549/DDP细胞系中的表达差异，采用westernblot进一步验证TGFBR2在A549及A549/DDP细胞系中的蛋白表达差异。通过miRBase及Ensemblgenomebrowser87

6、网站设计miR-9-1基因目的片段，PCR克隆长538bp的片段，酶切后连接于PCDH513B载体，转化及测序鉴定过表达质粒；根据miR-9-5p成熟体序列设计敲低miR-9-5p的吸附海绵并由华大基因公司合成；采用二代慢病毒质粒包装miR-9-5p过表达及敲低病毒。结果：华大测序分析预测：与A549细胞相比，miR-9-5p在A549/DDP细胞中的表达明显偏低，是A549细胞中的12.2%，然而TGFBR2在A549/DDP中的表达是A549细胞中的2.08倍。qRT-PCR及westernb

7、lot实验验证发现：miR-9-5p在A549/DDP细胞中的表达是A549细胞中43.54%，在A549/DDP细胞中TGFBR2的mRNA水平比A549细胞中高2.94倍；同样，TGFBR2蛋白量在A549/DDP细胞中表达增高。PCR克隆出538bp目的片段，成功构建于PCDH513B载体，测序验证正确，miR-9-1过表达载体及miR-9-5p海绵分别包装于293T细胞，72小时细胞显示GFP荧光。结论：miR-9-5p在A549细胞中表达比A549/DDP细胞高；相反，TGFBR2的mR

8、NA水平I万方数据暨南大学硕士学位论文及蛋白量在A549/DDP细胞中比A549细胞中高；与测序结果吻合。成功构建miR-9-1过表达载体及miR-9-5p海绵病毒，并成功包装慢病毒。关键词：miR-9-1；miR-9-5p海绵；慢病毒；TGFBR2；肺腺癌II万方数据暨南大学硕士学位论文第二部分miR-9-5p靶向TGFBR2调控肺腺癌细胞对顺铂耐药性及增殖的研究目的：构建TGFBR2的3’UTR（3’端非编码区）载体，通过海肾双荧光报告基因系统验证miR-9-5p对TGFBR2