靶向遗传印记基因peg10的sirna真核表达载体的构建及鉴定论文

《靶向遗传印记基因peg10的sirna真核表达载体的构建及鉴定论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、靶向遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体的构建及鉴定论文黄锦，林菊生，常莹，周秀敏【摘要】目的构建并鉴定针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体。方法根据PEG10基因cDNA序列，设计针对目的基因的4个siRNA靶序列，将其插入H1启动子下游，克隆到真核表达载体psiRNAhH1neo中，通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论本研究成功构建针对PEG10的真核表达载体.freelega公司产品。高纯质粒提取试剂盒购自杭州Vgene公司，DNA凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司。D

2、NA由上海生工生物工程公司合成。1.2方法1.2.1siRNA靶序列的设计和筛选利用NCBIGenbank检索PEG10mRNA的全长序列，参照siRNA设计原则，并运用RNAstructure软件模拟靶mRNA的二级结构，尽量避免自身结合的茎区，选择配对区域较少的序列，如线区和环区。筛选出4个21个核苷酸的序列，分别命名为psiRNA1（GCAGAAGCTCACAGAGGAGAA）、psiRNA2(GCACAACTACCCAGCTTTCAT)、psiRNA3(GGCAGTGCATTCACATTGAGA)和psiRNA4(GTTCGATGGCAACC

3、CAGACAT)。两端均引入BbsⅠ酶切位点。1.2.2靶向PEG10的siRNA真核表达载体的构建1.2.2.1shRNA表达模板的制备将化学合成的正义链和反义链退火，形成shRNA表达模板，表达模板由正义链＋loop（CCACC）＋反义链组成，两端为酶切位点。1.2.2.2psiRNAhH1neo载体酶切Invivogen公司psiRNAhH1neo质粒，H1启动子下游有两个BbsⅠ酶切位点，酶切反应后，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶回收2640bp片断，实验步骤按照华舜DNA凝胶回收试剂盒说明书操作。回收后通过紫外分光光度计定量。1.2.

4、2.3连接及转化将shRNA表达模板和psiRNAhH1neo酶切产物按4∶1的比例混合，T4DNA连接酶27℃连接过夜，转化感受态DH5α大肠杆菌中，取振摇后的转化菌，均匀涂抹在含χgal和IPTG的卡那琼脂平板上，倒置培养过夜。观察菌落生长情况，蓝白斑筛选，挑取白色单克隆。1.2.2.4质粒的扩增和提取将挑取的菌落分别接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃、250r/min振摇12～14h。取3ml转化菌液，按照Vgene公司超纯质粒抽提试剂盒说明书步骤提取质粒，取1μl在1％的琼脂糖电泳，通过灰度扫描定量。1.2.2.5质粒的鉴定①酶切

5、鉴定：将提取的重组质粒和psiRNAhH1neo空质粒，用限制性内切酶AseⅠ进行酶切鉴定。②测序鉴定：取1ml转化菌液，送上海英骏生物技术公司进行测序鉴定。测序引物：5’CCCTAACTGACACACATTCC3’，测序方法为反向测序。2结果2.1重组载体酶切鉴定结果用AseⅠ分别酶切重组载体和空载体，见图1，重组质粒酶切后呈线性化，电泳出一条带；空质粒组得到752bp和2227bp两条带；未经酶切的质粒分别为电泳出超螺旋环状DNA、线状DNA、切口环状DNA三条带。以上结果均与预期相符。1.psiRNAhH1neoAseⅠ;2.psiRNA1

6、AseⅠ;3.psiRNA1Lane;4.psiRNA2AseⅠ;5.psiRNA2;6.psiRNA3AseⅠ;7.psiRNA3;8.psiRNA4AseⅠ;9.psiRNA4;M.MarkerⅢ图1重组质粒酶切鉴定结果2.2测序结果将DNA测序结果通过DNAssist2.2软件进行比对，与预先设计结果完全相符。说明已将4个不同序列的siRNA分别成功克隆至载体psiRNA上，可以用于后续研究。3讨论遗传印记基因PEG10来源于病毒反转录转座子，是属于父方表达的印记基因。父方表达的印记基因可促进细胞的生长，使个体发育更加强壮，而这类基因的过表达就

7、有可能导致细胞的恶性转化24。研究发现，PEG10在小鼠再生肝和人类肝细胞癌组织中高表达，在相应的癌旁及正常人肝、胰、结肠、胃、淋巴和表皮中均不表达5，6。我们的前期研究表明，PEG10在肝癌组织中的表达具有特异性，人肝癌细胞系HepG2中PEG10高表达7。因此，PEG10有可能是一个潜在的肝癌基因治疗的分子靶。RNAi技术作为一种新的基因沉默手段，以其严格的序列特异性、高效性及高度稳定性的特点迅速成为研究的热点，并逐渐发展成为研究基因功能和肿瘤基因治疗的重要工具。目前常用的制备siRNA的方法有化学合成法、体外转录法、“鸡尾酒”法（RNaseI

8、II酶切dsRNA）、表达载体法和表达框法等5种，本实验采用的真核表达载体法克服了其他方法成本高，步骤繁琐的