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1、Survivin靶向siRNA重组表达载体的构建与鉴定杨红刘月波黄桂云张铀（通讯作者）（云南昆明医科大学第二附属医院血液科云南昆明650101）【摘要】目的构建Survivin靴向siRNA重组表达载体。方法根据GeneBank数据库提供的Survivin基因所有变异体的共同核苷酸序列，选择设计一对带发夹结构的核苷酸序列，克隆到空载体pSIREN-DNR-DsRed-Express中，转化DH5a菌株，提取质粒进行酶切鉴定和测序分析以及菌落PCR。结果经质粒PCR、菌落PC及测序证实Survivin靶
2、向siRNA重组表达载体结果与设计完全一致。结论Survivin靶向siRNA重组表达载体构建成功。【关键词】RNA干扰surviving基因治疗Survivn是凋亡抑制蛋白家族（lAPs）的新成员，独立于B型淋巴瘤细胞因子2（Bcl-2）家族，是迄今为止发现的作用最强的凋亡抑制因子。survivin蛋白调节所有细胞分裂和存活，并且广泛表达于人类大多数恶性肿瘤组织中[1],因此特异性针对survivin的基因治疗兵有良好的靶向性、特异性和安全性。木实验用基因克隆技术构建Survivin靶向的小干扰RN
3、A即siRNA重组表达载体，探讨用RNA+扰方法干扰肿瘤细胞中的Survivin基因的表达，从而为肿瘤的基因治疗提供理论依据。1材料与方法1.1大肠杆菌DH5a,质粒pSIREN-DNR-DsRed-Express购自大连宝生物公司，T4DNA连接酶，BamHI限制酶EcoRI限制酶，DNAMarker均购自大连宝生物公司。1.2靶向Survivin基因siRNA的设计Survivin基因序列来自GeneBank（编号NM001168）,利用GenechemTMsiRNA设计工具,参照siRNA设计原
4、则，在Survivin的序列中选取理论上最佳的一段作为靶序列为：5,-GGACCACCGCATCTCTACA-3,（78-96）,针对这段靶序列设计相应的DNA序列，经Blast分析证明与人类其他编码序列无同源性。在设计的寡核苷酸链中，两端分别为BamH1和EcoRI的酶切位点，能够与线性化的载体直接连接。人工合成2对互补并编码相应短发夹siRNA的寡核昔酸链。ShRNA-Survivinl（阳性）5-GATCCGGAACCACCGCATCTCTACATCGTGCTCCTGGTTGTGTAGAGATG
5、CGGTGGTCCTT1TTTG-3,（正义链），5-AATTCAAAAAAGGAACCACCGCATCTCTACACAACCAGGAGCACTATGTAGAGATGCGGTGGTCCG-3,（反义链）；ShRNA-Survivin2（阴性）：5-GATCCCCCAACGATCTGCACACGTTAGTGCTVVTGGTTGACGTGTGCAGATCGTTGGGTTT1TTG-3,（正义链），5-AATTCAAAAAACCCAACGATCTGCACACGTCAACCAGGAGCACTAACGTGTGC
6、AGATCGTTGGGG-3，（反义链）；下划线为连接酶位点。1.3线性化载体的制备将质粒pSIREN-DNR-DsRed-Express用BamHI和EcoRI双酶切，1°%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物并冋收大片段。1.4单链0的基因survivn片段的退火连接各用50μl退火缓冲液溶解上述合成20D的单链0的基因片度，稀释成0.010D/μl。各取lμl（即lμl正义链+lμl反义链）+lμl退火缓冲液混匀。94°C水浴退火，自然冷却至室温，30°C水浴90min
7、,4°C保存。1.5重组表达载体的连接与转化将稀释的Survivn退火片段与线性化的pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒表达载体违接。连接反应条件为：稀释的Survivin退火片段lμl,显性化的pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒载体lμl，10X连接酶缓冲液lμl,T4DNA连接酶lμl,H206μl,22°C水浴反应过夜。重组表达载体分别命名为Survivin-1，Survivn-2。各取5μl过夜连接产物转化感受态细胞DH5a
8、。1.6阳性克隆筛选和鉴定设计测序引物序列，由大连宝生物合成。pSIREN-Pl:5,-TGGGCTATGAACTAATGACC-3,pSIREN-P2:5,-TAATTTCTTGGGTAGTTTGC-3，将菌液涂布于含氨苄霉素抗性的LB平板上，37°C恒温箱培养过夜。然后各挑取8个单克隆菌落，浸泡在含20μl0.1%Triton液中置100°C加热2min,取2μl作模板，以pSIREN-Pl和pSIREN-P2为引物,进行PCR扩增，取1
