靶向骨桥蛋白shrna表达载体的构建与鉴定的论文

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1、靶向骨桥蛋白shRNA表达载体的构建与鉴定的论文【摘要】目的通过构建骨桥蛋白(osteopontin，opn)shrna表达载体，探索卵巢癌基因治疗新途径。方法根据基因库上的opn-mrna序列,设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用t4dna连接酶连接到线性化的psilence质粒中,并对重组质粒进行酶切及序列鉴定。结果opnsirna表达载体克隆构建成功，插入片段测序结果与合成的sirna结果一致。结论靶向opnshrna表达载体的构建成功为研究降低卵巢癌opn表达的抗肿瘤效应，及与放化疗的协同效应打下

2、了基础。【关键词】骨桥蛋白;shrna;表达载体;卵巢癌constructionandidentificationoftargetingosteopontinshrnaexpressionvector　　xuentofgynecologyobstetrics,affiliatedhospitalofxuzhoumedicalcollege,　　xuzhou,jiangsu221002,china)　　abstract:objectivetoexploretheneethodsonthebasisofopn-mrnageicsequence

3、database,anoligonucleotidechainconsistingof64basesrestrictionsitesatbothendsidpsilenceedigestionofrebinantplasmidandsequencing.resulttheopnsirnaexpressvectorcloningotherapy.　　keybion公司，该载体含有人h1启动子，包括bamhⅰ及hindⅲ酶切位点。　　大肠杆菌dh-5α购自碧云天生物有限公司。bamhⅰ、hindⅲ、t4dna连接酶购自mbi公司，质粒小量提取

4、试剂盒购自tiangen生物公司。dna凝胶回收纯化试剂盒购自promega公司。　　1.2实验室及仪器本实验在徐州医学院肿瘤生物治疗实验室完成。pcr仪(eppendorf公司)，高速离心机(eppendorf公司)，电热恒温水槽(上海跃进医疗器械厂)，摇床(太仓市实验设备厂)。　　1.3方法　　1.3.1sirna设计与合成根据genebank收录的骨桥蛋白的基因序列(nm000582)作为分析序列，采用ambion公司的网上设计软件()，参考sirna设计原则[4]，选择最佳干扰位点，本研究选取的靶位点是：acaggctgattct

5、ggaagt;agccaatgatgagagcaat;针对靶位点分别设计两条互补的寡核苷酸序列，寡核苷酸的两端带有与bamhⅰ和hindⅲ酶切位点互补的粘端序列，能够直接与经bamhⅰ和hindⅲ酶切的载体连接。并通过blast对所选择的靶序列进行同源分析,排除sirna非特异性抑制其他基因片段的可能。shrna序列茎环结构为9个与opn基因不互补的非同源碱基(ttcaagacg),末端终止子为tttttt。设计的具有发夹结构的shrna干扰片段序列如下。结构模式为:bamhⅰ+sense+loop+antisense+终止信号+hind

6、ⅲ。共设计了2对opn特异性sirna编码序列,如下：　　opn-shrna1:5′gatccgacaggctgattctggaagtttcaagagaacttccagaatcagcctgtt　　tttttggaaa-3′;　　反向互补序列：5′agcttttccaaaaaaacaggctgattctggaagttctcttgaaacttccagaatc　　agcctgtcg-3′;　　opn-shrna2:5′gatccgagccaatgatgacagcaatttcaagagaattgctgtcatcattggctt　　tttttgga

7、aa-3′;　　其反向互补序列:5′-agcttttccaaaaaaag　　ccaatgatgacagcaattctcttgaaattgctgtcatcattggctcg-3′。　　阴性对照序列:以上寡核苷酸序列单链由上海生工生物工程公司合成。　　1.3.2双链寡核苷酸的合成将合成的单链寡核苷酸溶解于无核酶水中，终浓度为1g/l。将互补的两条寡核苷酸各取2μl，加入46μl的退火缓冲液，置pcr反应仪上，设定反应条件为：90℃3min，37℃1h，得到退火产物。-20℃保存备用。　　1.3.3psilencer3.1-h1neo载体的线性

8、化取1.5mlep管，分别加入无核酶水78μl，10×buffer10μl，psilencer3.1-h1neo载体10μl，hindⅲ1μl，bamhⅰ1μl，混匀，37℃水浴保温8h。取酶