rockⅱ基因shrna质粒表达载体的构建与鉴定

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1、ROCKⅡ基因shRNA质粒表达载体的构建与鉴定作者：李晓江白云深杨有庚【摘要】目的构建表达Rho激酶(ROCK)Ⅱ特异性siRNA的重组质粒。方法按照Elbashir等设计原则和siRNA表达载体的要求，利用Ambion公司在线siRNATatgetfinder软件，设计带有BamHI、BbsI酶切黏性末端、终止识别序列和LOOP环的shRNA，并将其克隆入载体pGPU6/GFP/Neo，构建成ROCKⅡ特异siRNA重组质粒，然后进行酶切鉴定及基因测序。结果设计的shRNA成功克隆入载体pGPU6/GFP/Neo，构建成R

2、OCKⅡ特异siRNA重组质粒，酶切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符，目的基因序列准确无误。结论重组质粒构建成功，为今后体外或体内研究ROCK基因在脊髓损伤后的功能修复提供了一种有效的方法。【关键词】载体构建;RNA干扰;ROCK(Rho激酶)8　　RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程。将与靶基因转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(dsRNA)导入细胞后，生成的小干扰RNA(siRNA)与RNAi特异性酶结合，形成RNA诱导的沉默复合物，具有序列特异性核酸内切酶活性，能

3、特异性降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。本研究采用含H1启动子的载体pGPU6/GFP/Neo，针对ras基因超家族中Rho激酶(ROCK)基因的短发夹结构RNA(shRNA)构建靶向ROCKⅡ特异性shRNA真核表达载体，为今后体外或体内研究ROCK基因在脊髓损伤后的功能修复提供一种有效方法。　　1材料与方法　　1.1材料、试剂与仪器生化培养箱、震荡培养箱(金坛仪器厂)，荧光显微镜(OLYMPUS公司)。连接试剂盒、小量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒(QIAGEN公司)，限制性内切酶(TaKaRa公司)。　　1.2shRN

4、A序列设计及合成根据pGPU6/GFP/Neo中H1启动子启动表达siRNA对序列的要求,利用Ambion公司在线siRNATatgetfinder软件、.设计合成4条针对大鼠ROCK序列的siRNADNA片段，分析获得的序列，选择GC含量在40%～55%8之间的靶基因序列作为潜在优选，并在GenBank表达序列标签(EST)数据库中用BLAST检索，将选定的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除和其他编码序列同源的序列，以确定其为特异性序列。为了提高序列正确退火成为双链DNA分子的效率，将包含目的siRNA序列的DNA设计为用DN

5、A聚合酶合成的(PCR策略分别设计)包含目的基因siRNA序列的正义链和反义链寡核苷酸序列，在正义链和反义链序列加入间隔序列TTCAAGAGA，以避免形成终止信号，使其能形成发夹结构，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5′端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的黏端互补;反义链模板的5′端添加了GATC，与BamHI酶切后形成的黏端互补;如果siRNA的第1个碱基不是G，则在CACC后补加1个G。随机选取排列序列作为无干扰效果对照序列。编码siRNA的DNA序列由上海生工合成。4条寡核苷酸链及反义链见表1。表1设计、

6、合成的4对ROCK特异性siRNA位点、寡核苷酸链序列及GC含量　　1.3shRNA模板的退火将DNAoligo分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100μmol/L。取相应的正义链和反义链oligo溶液，按照如下配比配置退火反应体系：10×shDNA退火缓冲液5μl，正义链(100μmol/L)5μl，反义链(100μmol/L)5μl，ddH2O35μl，总体积50μl。在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃5min，85℃5min，75℃5min，70℃5min，4℃保存。退火处理后得到浓度为10μmol/L的shRNA

7、模板。将所得模板溶液稀释500倍，终浓度为20nmol/L，用于连接反应。　　1.4pGPU6/GFP/Neo载体的线性化取2μgpGPU6/GFP/Neo载体，按照如下体系进行酶切处理：10×缓冲液G5μl，BbsI2μl，BamHI2μl，pGPU6/GFP/Neo2μg，ddH2O41μl，总体积50μl。37℃酶切1h，琼脂糖电泳，使用AgaroseGelDNAPurificationKitVer2.0(TaKaRa)回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至50ng/μl。8　　1.5pGPU6/GFP/NeoshRNA载体的构

8、建按照如下体系进行载体的连接反应：10×T4连接缓冲液2μl，pGPU6/GFP/Neo(BbsI+BamHI)1μl，shRNA模板(20nmol/L)1μl，T4DNA连接酶(5weissU/μl)1μl，ddH2O15μl，总体