人notch1shrna慢病毒表达载体的构建与鉴定

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1、人notch1shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定：张燕,张明芳,林玲,郑志竑【摘要】　　目的构建人notch1shRNA慢病毒表达载体，为Notch信号通路的相关研究奠定基础。方法根据人notch1基因mRNA序列设计并合成两条互补的DNA单链寡核苷酸，将退火后形成的双链连接于pENTR/U6质粒，通过与pLenti6/BLOCKiTDEST载体的LR重组，构建notch1shRNA慢病毒表达载体，经脂质体介导入293FT细胞，包装成慢病毒。用该慢病毒感染人神经母细胞瘤系SHSY5Y细胞，RTPCR和慢病毒RNAi表达系统、293FT细

2、胞、大肠杆菌Top10、Stbl3化学感受态细菌、脂质体Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司);质粒抽提纯化试剂盒(荷兰QIAGEN公司，德国TIANGEN公司);TaqDNA聚合酶(美国Promega公司);DL2000DNAmarker(日本Takara公司);DMEM、PRMI1640培养基(美国Gibco公司);兔抗人Notch1抗体(美国Chemicon公司);小鼠抗人GAPDH抗体(美国SantaCruz公司);辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗兔IgG、HRP兔抗小鼠IgG抗体和ECL化学发光试剂盒(美国C

3、ellSignaling公司)。人神经母细胞瘤系SHSY5Y购自中科院上海细胞库。细胞寡核苷酸片段由南京金思科公司合成，PCR引物由上海Invitrogen英骏生物技术公司合成。其余试剂均为国产或进口分析纯。　　1.2方法　　1.2.1编码目的shRNA的单链DNA寡核苷酸片断的设计和合成根据GenBank中notch1基因mRNA序列(NM017617)，找出两条符合要求的靶序列：　　7745’CGACGATTGTCCAGGAAACAA3’794　　22415’GACCAACTGTGACATCAACAA3’2261　　参照BLOCK

4、iTTM慢病毒RNAi表达系统的要求，设计和合成两对针对靶序列和一对阴性对照的可形成茎环结构的正义链和反义链：　　notch1shRNA774:　　top链：5’caccGTTGTTTCCTGGACAATCGTCGcga　　aCGACGATTGTCCAGGAAACAA3’　　bottom链：5’aaaaTTGTTTCCTGGACAATCGTCGtt　　cgCGACGATTGTCCAGGAAACAAC3’　　notch1shRNA2241:　　top链：5’caccGTTGTTGATGTCACAGTTGGTCcg　　aaGACCAAC

5、TGTGACATCAACAA3’　　bottom链：5’aaaaTTGTTGATGTCACAGTTGGTC　　ttcgGACCAACTGTGACATCAACAAC3’　　阴性对照shRNA:　　top链：5’caccGTTCTCCGAACGTGTCACGTcgaaA　　CGTGACACGTTCGGAGAA3’　　bottom链：5’aaaaTTCTCCGAACGTGTCACGTttcg　　ACGTGACACGTTCGGAGAAC3’　　1.2.2重组pENTR/U6入门载体的构建合成的单链寡核苷酸序列经退火后，与线性化的载体pENTR/U

6、6行连接反应。常规方法转化Top10感受态细菌，在含卡那霉素的LB平板筛选重组克隆。PCR方法进行鉴定，引物为pENTR/U6的U6和M13测序引物，扩增程序为：94℃2min后进入循环，94℃30s→58℃30s→72℃30s，共25个循环，72℃终延伸7min。扩增序列长度为289bp，并由南京金思特公司进行序列测定。根据鉴定结果选出3个序列正确的菌株[分别含质粒pEntryNDA(shRNA774～794)、pEntryNDB(shRNA2241～2261)、pEntryNDContr(阴性对照shRNA)]进行后续实验。　　1.

7、2.3重组慢病毒载体的构建和鉴定取重组的入门载体与慢病毒骨架载体pLenti6/BLOCKiTDEST行LR重组反应。重组产物转化Stbl3感受态细菌，含氨苄青霉素的LB平板筛选重组克隆。用U6和V5引物行PCR反应，扩增程序为：94℃5min后进入循环，94℃30s→55℃30s→72℃60s，共25个循环，72℃终延伸7min。扩增序列长度为237bp。取PCR鉴定阳性的重组菌涂布于含氨苄青霉素或氯霉素的LB平板，观察有无菌落生长。将重组了pEntryNDA、pEntryNDB、pEntryNDContr的shRNA表达盒的慢病毒载

8、体相应称为LRNDA、LRNDB、LRNDContr。　　1.2.4慢病毒的包装和