人PAX6基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定-论文.pdf

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1、中华眼科医学杂志（电子版）２０１２年４月第２卷第２期ＣｈｉｎＪＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＭｅｄ（ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＥｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｒｉｌ２０１２，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．２·８９··论著·人ＰＡＸ６基因ｓｈＲＮＡ慢病毒载体的构建及鉴定黄悦李志清马志伟孙慧敏【摘要】目的体外构建人ＰＡＸ６基因的ｓｈＲＮＡ慢病毒载体并鉴定。方法实验研究。设计ＰＡＸ６基因特异性ｓｉＲＮＡ靶点，构建ＰＡＸ６ｓｈＲＮＡ重组质粒，构建表达ＦＬＡＧｔａｇ、ＰＡＸ６以及红色荧光蛋白报告基因的融合蛋白表达质粒，经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ加以验证，使用２９３Ｔ细胞进行有效靶点

2、的外源筛选。构建慢病毒ｐＧＣＬＧＦＰ载体，在２９３Ｔ细胞中包装病毒，将ｓｈＲＮＡ重组病毒感染人晶状体上皮细胞系（ＨＬＥＢ３），检测Ｂ３细胞ＰＡＸ６蛋白表达情况，从而筛选有效靶点。根据ＰＡＸ６基因的４个候选ＲＮＡｉ靶序列，构建ｓｈＲＮＡ重组质粒，并构建ＦＬＡＧｔａｇ、ＰＡＸ６、红色荧光蛋白融合蛋白的表达系统。结果经验证外源ＰＡＸ６基因，发现３个候选靶点是有效的ＲＮＡｉ靶点，能使ＰＡＸ６蛋白表达水平显著降低。在此基础上构建的ＰＡＸ６ｓｈＲＮＡ重组慢病毒载体，显著抑制了ＨＬＥＢ３细胞ＰＡＸ６蛋白的内源性表达。结论成功构建了人ＰＡＸ６

3、基因的ｓｈＲＮＡ慢病毒表达载体，在分子水平能够有效沉默靶基因，为后续探讨ＰＡＸ６对晶状体上皮细胞的生物学作用奠定了基础。【关键词】ＰＡＸ６；ＲＮＡ干扰；慢病毒；人晶状体上皮细胞ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｈｕｍａｎＰＡＸ６ｇｅｎｅｓｈＲＮＡｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＲＮＡｉｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙＨＵＡＮＧＹｕｅ，ＬＩＺｈｉｑｉｎｇ，ＭＡＺｈｉｗｅｉ，ＳＵＮＨｕｉｍｉｎ．ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＥｙｅＣｅｎｔｅｒ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００３８４，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅ

4、ｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＳＵＮＨｕｉｍｉｎ，Ｅｍａｉｌ：ｄｏｃｔｏｒｓｕｎｈｕｉｍｉｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ【Ａｂｓｔａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｈｕｍａｎＰＡＸ６ｇｅｎｅｓｈＲＮＡｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｉｎｔｈｅＨＬＥＢ３ｈｕｍａｎｌｅｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ．ＭｅｔｈｏｄｓＩｔｗａｓａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙ．ＰＡＸ６ｇｅｎｅｓｐｅｃｉｆｉｃｓｉＲＮＡｔａｒｇｅｔｓｗｅｒｅｄｅｓ

5、ｉｇｎｅｄ．ＰＡＸ６ｓｈＲＮＡｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｖｅｃｔｏｒ，ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｏｆＦＬＡＧｔａｇ，ＰＡＸ６ａｎｄａｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｗｅｒｅｂｕｉｌｔａｎｄｔｈｅｎｗｅｒｅｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ．Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｌｙｓｃｒｅｅｎｅｄｗａｓｔａｋｅｎｔｏｆｉｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔａｒｇｅｔｗｉｔｈ２９３Ｔｃｅｌｌｓ．Ｐａｃｋａｇｅｄｖｉｒｕｓｗｉｔｈｔｈｅｔｈｒｅｅｐｌａｓｍｉｄｓｙｓｔｅｍｔｏｉｎｆ

6、ｅｃｔＨＬＥＢ３ｃｅｌｌｓ，ＰＡＸ６ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｏｆｉｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔａｒｇｅｔ．ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｈＲＮＡｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｉｎａｃｃｏｒｄａｎｃｅｗｉｔｈｔｈｅｆｏｕｒｃａｎｄｉｄａｔｅＰＡＸ６ｇｅｎｅＲＮＡｉｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｅＦｌａｇｔａｇ，ＰＡＸ６ａｓｗｅｌｌａｓｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．ＲｅｓｕｌｔｓＩｔｗａｓｐｒｏｖｅｄ

7、ｔｈａｔｔｈｅｔｈｒｅｅｃａｎｄｉｄａｔｅｔａｒｇｅｔｗｅｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅＲＮＡｉｔａｒｇｅｔｓｗｈｉｃｈｅｎａｂｌｅｄＰＡＸ６ｐｒｏｔｅｉｎｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．ＡｎｄｔｈｅｔｈｒｅｅＰＡＸ６ｓｈＲＮＡｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｗｈｉｃｈｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｏｎｔｈｉｓｂａｓｉｓｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔＢ３ｈｕｍａｎｌｅｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅｆｒｏｍｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＰＡＸ６．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓＣｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈ

8、ｅＰＡＸ６ｇｅｎｅｓｈＲＮＡｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒａｎｄｓｉｌｅｎｃｅｄｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓａｔｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈｌａｉｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏ