大鼠trail基因慢病毒载体的构建及鉴定

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1、中图分类号：R392-33硕士学位论文大鼠Trail基因慢病毒载体的构建及鉴定院（系）、所临床医学院研究生姓名张海学科、专业外科学导师姓名蒋正方教授二Ο一二年四月1目录1大鼠Trail基因慢病毒载体的构建及鉴定…………….21.1.1中文摘要………………………………………………2-31.1.2英文摘要………………………………………………3-41.2前言……………………………………………………4-51.3流程图...................................................................

2、.........5-61.4.1实验材料………………………………………………6-91.4.2实验方法………………………………………………9-261.4.3实验结果……………………………………………..26-341.5讨论…………………………………………………...34-411.6结论………………………………………………….......421.7.1参考文献……………………………………………..42-431.7.2英汉缩略词对照表…………………………………..44-451.7.3致谢…………………………………………………...45-471.

3、8TRAIL研究现状（综述一）„„„„„„„„„47-581.9慢病毒载体的构建与应用进展(综述二)………….大鼠Trail基因慢病毒载体的构建及鉴定摘要目的:本实验用PCR法扩增出的Trail基因引入慢病毒载体系统，生产Trail慢病毒颗粒并进行病毒滴度检测。方法:1.Trail基因的获得：根据2GenBank中大鼠Trail基因序列(NM145681.1)，设计出该基因的特异性引物Trail-Agel-F和Trail-Agel-R，并且使用Agel酶的切位点。用PCR法从大鼠cDNA文库中扩增出目的基因。2.重组质粒的构建：采用In-F

4、usion技术，将酶切回收后的PCR产物线性交换连接入Agel酶切的真核表达载（GV218），产生目的重组质粒。连接产物质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，扩增目的重组质粒。3.连接产物的酶切鉴定：收集扩增后的连接产物，酶切后经电泳发现得到片段长度均与预期相符，基因测序结果亦正确，从而证明克隆Trail基因已成功。4.重组质粒转染293T细胞：用脂质体Lipofeetamine2000包裹构建的重组质粒和辅助包装载体，三质粒共同转染293T细胞，产生含有表达Trail蛋白的Lentivirus病毒颗粒。5.病毒检测：重组质粒转入293T细胞

5、,荧光显微镜下观察GFP的表达，行Westernblot鉴定及使用Real-time定量PCR法检测病毒滴度。结果:成功得到Trail目的基因，重组质粒测序结果与GenBank中Trail基因序列(NM145681.1)比较，证实Trail基因序列正确；三质粒转染293T细胞后荧光显微镜观察到绿色荧光；WesternBlot检测观察到58KD附近处有特征条带，其大小和目的基因融合蛋白相吻合；孔稀释法及实时荧光定量PCR病毒滴度测定法测定结果为2E十8TU/ml。结论:成功克隆大鼠Trail基因和成功构建慢病毒载体系统并检测其滴度。为后续把有

6、杀灭肿瘤的基因（Trail）转导进神经干细胞奠定基础。关键词:慢病毒，载体，Trail，基因ConstructionandidentificationofratTrailgenerecombinantlentivirusvector3.Abstract：Objective:thisexperimentusingthemethodofPCRamplifiedTrailgeneintoslowvirusvectorsystem,theproductionofTrailvirusparticlesandvirustiter.Methods:the

7、1.Trailgenewasobtained:accordingtoGenBankinratTrailgenesequence(NM145681.1),todesignthegenespecificprimersofTrail-Agel-FandTrail-Agel-R,anduseAgelenzymecuttingsite.UsingthemethodofPCRfromratcDNALibraryoftheamplifiedgene.2constructionofrecombinantplasmids:usingIn-Fusiontech

8、nology,theenzymerecoveryafterPCRproductslinearswitchedconnectionintotheAgelrestrictionofe