CRBP1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

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1、CRBP-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定作者：陈波，李建平，戴途，吴志勇，罗蒙，孙勇伟【摘要】目的：构建大鼠视黄醇结合蛋白-1(cellularretinol-bindingprotein-I，CRBP-1)基因RNAi（RNAinterference，RNAi）慢病毒载体。方法：针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。结果：PCR鉴定与DNA测

2、序证实合成的含CRBP-1shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论：成功构建大鼠CRBP-1基因RNAi慢病毒载体。【关键词】RNA干扰；视黄醇结合蛋白-1；慢病毒[Abstract]Objective：ToconstructalentiviralvectorofRNAinterference（RNAi）ofratcellularretinol-bindingproteinI(CRBP-I)gene.Methods：TheeffectivesequenceofsiRNAtargetingCRBP-Igenewasconfir

3、medinourpreviousstudy.ThecomplementaryDNAcontainingbothsenseandantisenseOligoDNAofthetargetingsequencewasdesigned，synthesizedandclonedintothepGCL-GFPvector，toconstructalentiviralvector8whichexpressedshorthairpinRNA(shRNA)，anditwasidentifiedbyPCRandDNAsequencing.Resul

4、ts：PCRidentificationandDNAsequencingdemonstratedthatinsertionofoligonucleotideofthelentivirusRNAivectorcontainingCRBP-IshRNAwasright.Conclusion：ThelentivirusRNAivectorofratCRBP-Iwasconstructedsuccessfully.[Keywords]RNAinterference；Cellularretinol-bindingproteinI；Lent

5、ivirus肝星状细胞（hepaticstellatecells，HSC）的激活过程是肝脏胶原产生和肝纤维化形成的中心环节[1]，在肝纤维化逆转过程中也起重要作用，2002年UchioK[2]在用CCl4制备大鼠肝纤维化模型中发现，活化第5天的HSC中CRBP-1表达明显增加，而视黄醇脂滴消失，提示CRBP-1与肌成纤维样细胞的形成密切相关。近年来，随着RNAi技术的出现，为研究内源性基因功能和信号转导途径提供了强有力的研究工具。我们在已经获取CRBP-1基因的RNAi有效靶序列的基础上，设计、构建和鉴定表达CRBP-1shRN

6、A的慢病毒载体，为后期研究CRBP-1基因在HSC活化中的作用机制和肝纤维化的基因治疗打下基础。1材料和方法81.1材料PCR用试剂primer、dsDNAOligo（上海吉凯基因技术有限公司合成），大肠杆菌菌株DH5α，DMEM，胎牛血清、胰蛋白酶（Invitrogen公司）。慢病毒载体系统（Tronolab公司www.tronolab.com/lentivectors.php）.该病毒包装系统由pGCL-GFP载体，pHelper1.0(gag/pol元件)载体，Helper2.0(VSVG元件)载体三质粒组成，其中pGCL

7、-GFP载体含有能持续表达小RNA的元件，同时能表达荧光蛋白marker(GFP/RFP)，pHelper1.0和pHelper2.0含有病毒包装所必须的元件。限制性内切酶、T4DNA连接酶（NewEnglandBiolabs公司）。1.2方法1.2.1双链DNAOligo制备用Ambion公司的设计软件，设计、合成3对针对CRBP-1基因shRNA的寡核苷酸序列，经分别构建质粒，转染293细胞，据其对CRBP-1的抑制率，确定有效靶序列：Pscsi-1:CCGCAAGTGCATGACCACA，（CRBP-1mRNANM_012

8、733，GenBankGI:77416367）.设计并合成其shRNA的DNAOligo：Pscsi495-1：5'-CCGGGACC-CAAGTGCATGACCACACTCGAGTGTGGTCATGCA-8CTTGCGGTCTTTTTG-3'，Pscsi495