间皮素rnai重组慢病毒载体的构建和鉴定.doc

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1、间皮素RNAi重组慢病毒载体的构建和鉴定【摘要】目的：针对间皮素(MSLN)构建RNAi重组慢病毒质粒并用慢病毒包装，探讨MSLN功能.方法：根据MSLN基因信息，用慢病毒质粒载体pRNATU6.2/Lenti构建了三个携带小干扰序列和一个阴性对照序列的重组质粒，转染OVCAR3细胞后，检测RNA干扰效率，选择干扰效率高的质粒载体进行慢病毒包装，并检测病毒滴度，用慢病毒感染细胞再次检测RNA干扰效率和对细胞粘附功能的影响.结果：测序结果证明四种质粒载体的插入序列完全正确.脂质体转染重组慢病毒质粒pRNATsiRNA3的

2、RNA干扰效率最高，为67.5%.鉴定慢病毒包装成功，病毒滴度为1x108ifu/mL.pRNATsiRNA3慢病毒感染细胞的mRNA干扰效率为78%,pRNATsiRNA3慢病毒干扰组细胞粘附率为(15.1±1.3)%明显低于阴性对照组(33.4±8.2)%和空白对照组(30.0±5.8)%,差异均有统计学意义(P<0.05).结论：pRNATsiRNA3慢病毒的感染能显著抑制OVCAR3细胞MSLN表达以及粘附能力.MSLNRNAi重组慢病毒质粒载体的制备成功为进一步研究MSLN功能和用慢病毒进行基因治疗建立了一个

3、良好的平台.【关键词】间皮素；慢病毒属；RNA干扰；卵巢肿瘤；细胞粘附ConstructionandidentificationofarecombinantlentiviralvectorofRNAinterferenceofmesothe1ingeneWANGLi,WUXiaoHua,LINaDepartmentofObstetricsandGynaecology,FourthHospila1ofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China[Abstract]AIM:

4、ToconstrusctarecombinantlentivirusplasmidofRNAinterferenceofmesothelingene.METHODS:AccordingtotheGenBankinformalionofmesothelin,threeinterferingsequenceandanegativesequenceweredesignedandinsertedintoplasmidpRNATU6.2/Lenti.OVCAR3cel1wastransfectedanddetectedbyrea

5、ltimePCR.Theplasmidwiththehighestinterferingefficiencywaspackagedbypackagingplasmidmix.Thetiterofviruswastested.OVCAR3cellswereinfectedbylentivirus,andiIsadhesiveabiIitywasdetected.RESULTS:DNAsequencingshowedthatthesequenceofrecombinantlentivirusplasmidwascorrec

6、t.TheplasmidwiththehighestinterferingefficiencywaspRNATsiRNA3,andtheinterferingefficiencywas67.5%.Thetiterofviruswas1x108ifu/mL.Theinterferingefficiencyoflentiviruswas78%.Cel1adhesiontestsshowedthatOVCAR3cellsinfectedbypRNATsiRNA3lentivirusadheredlesseffectively

7、tomatrigel(15.1±1.3)%thancontrolgroups[(33.4±8.2)%,(30.0±5.8)%,(P<0.05)].CONCLUSION:InfectionofpRNATsiRNA3lentivirussignificantlyinhibitsmesothelinexpressionandcel1adhesion.ThesuccessfulconstructionoflentivirusvectorofRNAinterferenceofmesothelingenelaysafoundati

8、onforfurtherstudyofthefunctionandgenetherapyofmesothelin.[Keywords]mesothelin;lentivirus;RNAinterference;ovarianneoplasms;celIadhesion0引言间皮素（mesothelin,MSLN）是一种近年发现的肿