间皮素rnai重组慢病毒载体的构建和鉴定

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1、间皮素RNAi重组慢病毒载体的构建和鉴定【摘要】　　目的：针对间皮素（MSLN）构建RNAi重组慢病毒质粒并用慢病毒包装，探讨MSLN功能.方法：根据MSLN基因信息,用慢病毒质粒载体pRNATU6.2/Lenti构建了三个携带小干扰序列和一个阴性对照序列的重组质粒，转染OVCAR3细胞后，检测RNA干扰效率，选择干扰效率高的质粒载体进行慢病毒包装，并检测病毒滴度，用慢病毒感染细胞再次检测RNA干扰效率和对细胞粘附功能的影响.结果：测序结果证明四种质粒载体的插入序列完全正确.脂质体转染重组慢病毒质粒pRNATsiRNA3的RNA干扰效率最高,为67

2、.5%.鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度为1×108ifu/mL.pRNATsiRNA3慢病毒感染细胞的mRNA干扰效率为78%，pRNATsiRNA3慢病毒干扰组细胞粘附率为（15.1±1.3)%明显低于阴性对照组(33.4±8.2)%和空白对照组(30.0±5.8)%，差异均有统计学意义(P＜0.05).结论：pRNATsiRNA3慢病毒的感染能显著抑制OVCAR3细胞MSLN表达以及粘附能力.MSLNRNAi重组慢病毒质粒载体的制备成功为进一步研究MSLN功能和用慢病毒进行基因治疗建立了一个良好的平台.【关键词】间皮素；慢病毒属；RNA干扰；卵

3、巢肿瘤；细胞粘附　　ConstructionandidentificationofarebinantlentiviralvectorofRNAinterferenceofmesothelingeneedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China【Abstract】AIM:ToconstrusctarebinantlentivirusplasmidofRNAinterferenceofmesothelingene.METHODS:AccordingtotheGenBankinformationofmesothelin,t

4、hreeinterferingsequenceandanegativesequenceidpRNATU6.2/Lenti.OVCAR3cellePCR.Theplasmididmix.ThetiterofvirusididL.Theinterferingefficiencyoflentivirusatrigel(15.1±1.3)%thancontrolgroups［(33.4±8.2)%,(30.0±5.8)%,(P＜0.05)］.CONCLUSION:InfectionofpRNATsiRNA3lentivirussignificantlyin

5、hibitsmesothelinexpressionandcelladhesion.ThesuccessfulconstructionoflentivirusvectorofRNAinterferenceofmesothelingenelaysafoundationforfurtherstudyofthefunctionandgenetherapyofmesothelin.【Keyesothelin;lentivirus;RNAinterference;ovarianneoplasms;celladhesion　　0引言　　间皮素（mesothelin,

6、MSLN）是一种近年发现的肿瘤相关抗原，通常仅表达在胸膜腔、腹膜腔和心包腔的间皮细胞，但在恶性胸膜间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌等恶性肿瘤中过表达.MSLN可能是CA125的配子，两者共同参与细胞粘附，并且具有很高的亲和力，与卵巢癌的腹腔种植有关，并参与肿瘤转移［1］.但迄今为止，有关MSLN功能研究的报道还很少见.本研究旨在通过针对MSLN的RNA干扰(RNAinterferenceRNAi)重组慢病毒载体的构建和慢病毒包装，以探讨MSLN的粘附功能和利用慢病毒进行基因治疗的可能性.1材料和方法1．1材料人卵巢浆液性囊腺癌细胞系OVCAR3由河北医科大学第四

7、医院科研中心提供.人胚肾293T细胞购自中科院细胞库.慢病毒质粒pRNATU6.2/Lenti（美国Genscript公司）；质粒抽提试剂盒（美国Axygen公司，德国Qiagen公司）；转染试剂LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司）；慢病毒包装试剂盒pPACKH1LentivectorPackagingKit（美国SBI公司）；小干扰序列和引物由上海生工合成；低分子量蛋白Marker，蛋白质提取试剂盒等（北京赛百盛生物公司）；检测用抗体：MSLN鼠抗人mAbK1(美国ZYMED公司)；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠多抗,β

8、actin抗体(中杉金桥生物公司)；人工基底膜材料Matrigel(美国BD公