TATBACEspGFP三融合基因慢病毒载体的构建与鉴定.doc

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1、TATBACEspGFP三融合基因慢病毒载体的构建与鉴定（作者:单位:邮编:）作者：王洪权，胡海涛，靳辉，张海英，崔媛媛，董炜疆【摘要】目的构建穿膜肽基因和BACE底物肽融合基因与绿荧光融合基因慢病毒载体，为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗奠定基础。方法利用非对称互补引物/模板法制备两端含有酶切位点的TATBACEsp融合基因的cDNA,使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒FUGW中，经限制性酶切和测序鉴定重组载体。结果限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实获得的TATBACEsp产物与设计的完全吻合；TATBACEsp准确克隆入FUGW的多克隆位点。结论成功构

2、建了TATBACEsp与GFP融合基因慢病毒载体，为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗提供了适合的稳定转染的载体。【关键词】阿尔茨海默病；0分泌酶；穿膜肽；融合基因；慢病毒载体ABSTRACT:ObjectiveToconstructtheTATBACEspGFPtriplefusionproteinexpressedfromrecombinantlentiviralvector.MethodsThetargetfragmentTATBACEsp,whichwasamplifiedbyPCRbymeansofasymmetricalprimer/template

3、,wasrecombinedtothedownstreamofCMVpromoterofthelentiviralvectorFUGW.Theconstructionobtainedwassequeneedtoverifytheintegrityofthereadingframeandthefidelityofthesequence.ResultsTheevidenceofrestrictionenzymesdigestionandDNAsequeneeanalysisshowedthattheinsertwasTATBACEspcDNA,consistent

4、withthefragmentTATBACEspfusiongenewedesigned.ConelusionThelentiviralvectorexpressingTATBACEspGFPtriplerecombinantfusiongenehasbeensuccessfullyconstructed,anditmaybeareliablerecombinantvectorontheroadtotherapeuticsforAlzheimersdisease.KEYWORDS:Alzheimersdisease;TAT;BACE;fusiongene;le

5、ntiviralvector阿尔茨海默病(Alzheimersdisease,AD)是神经系统变性性疾病，其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有B淀粉样蛋白(BAmyloid,AR)的沉积、神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles,NFT)、大量记忆性胆碱能神经元数目减少以及老年斑(senileplaque,SP)的形成。AD的病因目前仍不明确，也没有确切有效的治疗方法，故探索预防和治疗AD的有效措施刻不容缓。AD发病机理的A0学说认为APP的酶切代谢产物AR在AD发病早期中起主要的作用口］，具有神经毒性的A0在特定脑区聚积是AD起始因素［

6、2］。0分泌酶BACE是A0产生的关键酶。因为0分泌酶催化A

7、3产生是起始步骤,所以抑制P分泌酶可以减少A0的产生［3］。于是,BACE抑制剂的研发引起了研究者的广泛兴趣。Ghosh等［4］报道了BACE1的抑制剂，在体外可抑制BACE的活性。目前，BACE1抑制剂大都是以底物为基础的过度态类似物，用化学方法直接合成0分泌酶的抑制剂费用高昂且此抑制剂难以通过血脑屏障进入脑内。因此，在AD的防治中存在效果不佳、副作用较大等不足，探索新的疗效好、副作用小的途径依然是医学工作者面临的难题。HIV1TAT蛋白转导结构域(proteintransductiondomai

8、n,PTD)具有细胞间扩散的特性，近来的研究表明TAT可以介导不同融合蛋白转导［57］oTAT融合蛋白可以在体内转导蛋白［8］。重要的是包括脑在内不同组织间可以检测到TAT报告基因融合蛋白［9］。TAT的发现在蛋白功能和疾病治疗的研究中具有重要的应用价值［10］。本研究以B分泌酶的底物特异性为基础，用基因重组技术，将BACE底物肽的基因和TAT的基因进行融合，构建TATBACEsp与GFP融合基因慢病毒载体［11］,以期在细胞和动物水平为慢病毒载体介导的BACE底物肽融合基因治疗阿尔茨海默病奠定基础O1材料与方法1.1材料大肠杆菌E.coliDH5a由本实验室

9、保存;TOP10感受态菌购自Tiang