目的基因慢病毒载体的构建与包装.pdf

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1、·766·中华实用诊断与治疗杂志2012年8月第26卷第8期JournalofChinesePracticalDiagnosisandTheraPy·论著·目的基因慢病毒载体的构建与包装王孟丽，马建党，侯小霞(洛阳市中心医院检验科，河南省471000)[摘要]目的探讨Oct4，Sox2，c—Myc及Klf4一慢病毒载体的构建与包装。方法从含有Oct4，Sox2，c—Myc及Klf4的质粒中获取目的基因，将目的基因与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接，其连接产物转化细菌感受态细胞，对长出的阳性克隆进行测序和比对分析，并

2、对长出的阳性克隆进行PCR鉴定，通过三质粒系统共转染293T细胞对慢病毒进行包装并进行滴度测定。结果成功构建并包装出Oct4，Sox2，c—Myc及Klf4一慢病毒载体，基因测序结果与目标序列完全一致；PCR鉴定结果显示，4个目的基因均为阳性；Oct4，Sox2，c—Myc及Klf4一慢病毒载体滴度分别为1×10，1×1O，1×lo。，2×10。Tu／mL。结论通过三质粒系统可构建并包装Oct4，Sox2，c—Myc及Klf4一慢病毒载体。[关键词]慢病毒载体；构建；目的基因；包装中图分类号：R373文献标志码：A文

3、章编号：1674—3474(2012)08—0766—03ConstructionandpackingoflentivirusvectorsWANGMeng—li．MAJian—dang．H0UXiao—xia(DepartmentofLaboratory，LuoyangCentralHospital，Louyang471000，China)[Abstract]ObjectiveToexploretheconstructionandpackingoflentivirusvectorsincludingOct4，Sox

4、2，c—MycandKlf4．MethodsTheobjectivegeneswereacquiredfromtheplasmidconsistingOct4，Sox2，c—MyeandKlf4，andweredirectionallyconnectedtotheenzymelinearizedlentivirusvectors．Theproductionwastransformedintocompetentbacteria．Thepositiveclonesweresequencedandcomparedwhenp

5、ositiveobjectiveplasmidwassuccessfullyconstructedwithLisePCRtechnique．Three—plasmidsystemwasusedtotransfect293Tcellsforpackinglentivirusandtestingthetiteroflentivirus．ResultsLentivirusvectorsweresuccessfullyconstructedandpackedincludingOct4，Sox2，cMycandKlf4．The

6、sequenceofgenewasconsistentwithobjectivesequence．Oct4，Sox2，c—MycandKlf4wereexpendedpositivelywithPCRtechnique．ThetitersofOct4，Sox2，c—MycandKlf4were1×10。，1×10。，1×10and2×10TU／mI．ConclusionThree—plasmidsystemcansuccessfullyconstructandpacklentivirusvectorsincludin

7、gOct4，Sox2，c—MycandKlf4．[Keywords~Lentivirusvector；construction；objectivegene；packing胚胎干细胞具有自我更新、复制和多向分化的潜pGC—LV重组载体；(2)pHelper1．0；(3)pHelper2．0。能，但由于受伦理和法律限制，目前已开展的诱导性多DNA溶液制备：以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提能干细胞研究多采用来源于人类免疫缺陷病毒1的取慢病毒包装系统中3种质粒DNA，质粒DNA溶于慢病毒载体_】]。此载体除具有一般反转录

8、病毒的基本除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保结构基因外，还包含4个辅助基因和2个调节基因l_2]，证所提质粒DNA的A。。／A。为1．8～2．0。并含有RNA分子和酶_3]，为此项细胞技术的研究奠1．2方法定了基础。本研究探讨构建并包装目的基因慢病毒载1．2．1Oct4，Sox2，c—Myc及Klf4一慢病毒载体构建体，报道如下。