钙周期素结合蛋白基因亚细胞定位慢病毒载体的构建及慢病毒包装的研究

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1、分类号：R5单位代码：10752密级：公开学号：2009223宁夏医科大学硕士研究生学位论文钙周期素结合蛋白基因亚细胞定位慢病毒载体的构建及慢病毒包装的研究ConstructionofCacyBPGeneSubcellularLocalizationLentivirusVectorsandPackagingoftheLentivirus学位申请人：仇长青指导教师：翟惠虹副教授申请学位门类级别：医学专业名称：内科学研究方向：大肠癌的早期诊断所在学院：临床医学院论文完成日期：二○一二年四月宁夏医科大学研究生院Nin

2、gxiaMedicalUniversityThesisforApplicationofMaster’sDegreeConstructionofCacyBPGeneSubcellularLocalizationLentivirusVectorsandPackagingoftheLentivirusStudent’sName:QiuChangqingSupervisor：ZhaiHuihongProfessorSubjectCategory:MedicineMajor:InternalMedicineSpecial

3、ty:DigestiveSystemCancerCollege:ClinicalInstituteCompletionDate:Apr.2012宁夏医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿

4、＿＿＿＿年月日年月日宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日宁夏医科大学硕士研究生学位论文中文摘要钙周期素结合蛋白基因亚细胞定位慢病毒载体的构建

5、及慢病毒包装的研究摘要目的构建钙周期素结合蛋白（calcyclinbindingprotein,CacyBP）基因的亚细胞定位慢病毒载体并进行慢病毒的包装与滴度测定。方法以结肠癌HCT-116细胞株的cDNA序列为模板，根据CacyBP基因序列设计并合成引物，PCR扩增编码CacyBP的基因片段并回收纯化；采用NcoI/XhoI双酶切后定向克隆到亚细胞定位载体：pCMV/myc/nuc（胞核定位载体）和pCMV/myc/cyto（胞浆定位载体）；转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素阳性LB培养基平板上筛

6、选出阳性克隆；重组质粒经PCR及双酶切鉴定并进行测序。以pCMV/myc/nuc-CacyBP，pCMV/myc/cyto-CacyBP，pCMV/myc/nuc-GFP为模板，选择适当的引物PCR后得到含EcoRI和NheI酶切位点的CacyBP-NLS，CacyBP基因片段；含AgeI和EcoRI酶切位点的GFP-NLS基因片段；将其构建到慢病毒载体上得到重组质粒LV-GFP-hCacyBP-NLS，LV-GFP-hCacyBP，LV-GFP-NLS，酶切并测序鉴定正确后，将重组载体与慢病毒辅助包装载体pH

7、elper1.0及pHelper2.0共转染293T细胞后包装出复制缺陷型慢病毒颗粒，而后qPCR法测定慢病毒滴度。结果1.从HCT-116的cDNA模板扩增684bp的CacyBP基因片段，分别构建重组质粒pCMV/myc/nuc-CacyBP、pCMV/myc/cyto-CacyBP，PCR及双酶切鉴定产物大小与预期值相符合，测序分析进一步表明所克隆的基因为编码CacyBP的基因片段。2.通过感染293T细胞，测得重组慢病毒LV-GFP-CacyBP-NLS，LV-GFP-CacyBP，LV-GFP-NLS

8、滴度分别为2E+8TU/ml，2E+9TU/ml，2E+8TU/ml。结论1.成功构建CacyBP基因的亚细胞定位慢病毒载体。I宁夏医科大学硕士研究生学位论文中文摘要2.重组慢病毒载体和辅助质粒成功包装成高滴度的慢病毒颗粒。3.为后续将此慢病毒感染人结肠癌SW480细胞，研究其定位于胞核、胞浆中对细胞恶性表型的调节作用提供了一个平台。关键词钙周期素结合蛋白基因，胞核定位载体，胞浆定位载