人FGF―9慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

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1、人FGF-9慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定人FGF—9慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定［摘要］目的构建人成纤维细胞生长因子-9(FGF-9)慢病毒表达载体，鉴定其表达，并对慢病毒载体进行包装，为在体及体外研究FGF-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。方法PCR扩增人FGF-9基因。全长序列交换入线性表达载体，连接产物转化感受态细胞，PCR及基因测序鉴定阳性克隆。重组质粒转染293T细胞，荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(eGFP)表达，Western-blot鉴定FGF-9表达。重组病毒质粒在脂质体介导下与结构质粒和包膜质粒共转染293T细胞包装成人FGF-9过表达慢病

2、毒,RT-qPCR测定滴度。结果PCR及测序证实人FGF-9基因正确克隆至病毒质粒；感染293T细胞后，荧光显微镜观察到eGFP,Western-blot检测到FGF-9融合蛋白表达；三质粒共转染293T细胞获得慢病毒，测其浓度为2X108TU/mLo结论成功构建人FGF-9慢病毒表达载体，可在293T细胞中表达，并包装成慢病毒，为在体及体外研究FGF-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。［关键词］成纤维细胞生长因子-9；慢病毒；肿瘤［中图分类号］R3［文献标识码］A［文章编号］1673-7210(2013)10(c)-0016-04人成纤维细胞生长因子-9(FGF-9)是

3、人成纤维细胞生长因子的家族成员之一，最初发现于人类神经胶质瘤细胞［1］,定位于人13qll-ql2t染色体［2］,长约34kb,包括3个外显子和2个内含子;该基因编码区有627个脱氧核苜酸，编码208个氨基酸。许多研究表明，FGF-9异常表达，可导致多种疾病的发生，如子宫内膜异位症及肿瘤［3］。Todo等［4］研究了4株人胶质瘤细胞系，发现FGF-9对其中3株有促增殖作用，这一作用的强弱与FGF-9的剂量正相关。Granerus等［5］在对崎胎瘤细胞系的研究中发现，FGF-8与FGF-9均可促进细胞倍增，但二者的作用效力不同：加入同等量的FGF-8与FGF-9,后者可引起细胞骤

4、增，而前者效果相对较弱。Ueng等［6］研究摩托尾气部分提取物（MEP）的促癌机制，在细胞水平发现MEP可使肺癌细胞系CL5屮多种蛋白表达水平改变，其屮包括FGF-9表达上调；在动物水平，大鼠每天吸入2h摩托尾气持续吸入4周，其肺组织中FGF-9表达增加。慢病毒载体现已广泛用于基因稳定转染表达及shRNA介导的基因敲除技术。其优点为［7］：①可将携带的基因稳定持续转染至宿主基因组；②可转染分裂及未分裂细胞；③转染后无病毒蛋口复制；④可携带复杂基因信息；⑤安全整合；⑥载体系统构建相对较简单。故在基因研究及基因治疗领域中，慢病毒逐渐受到青睐。木研究旨在构建人FGF-9慢病毒表达载体

5、，鉴定其表达产物，并对慢病毒载体进行包装，为在体及体外研究FGF-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。1材料与方法1.1材料大肠杆菌菌株DII5a、293T慢病毒包装细胞为本实验室保存；含FGF-9片段的293T慢病毒包装细胞质粒购口Clontech公司；PGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP载体、结构质粒pllelper1・0和包膜质粒pllelper2.0购自上海吉凯基因化学技术有限公司；其余试剂均为进口或国产化学分析纯。PCR仪购自AppliedBiosystems公司；positiveclone测序仪购自美季生物技术公司；荧光显微镜购自奥林帕斯公司。1.2方法

6、1.2.1目的基因PCR扩增、酶切依据FGF-9基因信息设计PCR引物，由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。引物序列：5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCTCCCTTAGGTGAAG-3,（上游），5'-TCCTTGTAGTCCATACCGCTTTGGCTTAGAATATCC-3'（下游）。以含FGF-9片段的质粒为模板，PCR钓取目的基因，电泳检测。回收预期668bp大小PCR产物片段。冃的基因PCR产物双酶切。1.2.2重组质粒构建pGC-FU-3FLAG-SV40-EGFP载体AgeI酶切,目的基因PCR产物交换入线性表达载体，将连接产物

7、转化到感受态细胞。PCR鉴定长出的克隆。阳性克隆基因测序。1.2.3冃的基因过表达载体检测处于对数生长期的293T细胞胰酶消化，制成细胞悬液，接种于24孔细胞培养板屮。依据InvitrogenLipofectamine2000转染试剂使用说明书进行转染操作。转染24h后，观察质粒上荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的表达。转染36h后，收集细胞，Western-Blot检测目的基因融合蛋白的表达。1.2.4慢病毒包装重组病毒质粒在脂质体Lipofectamine2000介导下与结构质