人notch1shrna慢病毒表达载体的构建与鉴定

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1、人notch1shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定作者：张燕,张明芳,林玲,郑志竑【摘要】　　目的构建人notch1shRNA慢病毒表达载体，为Notch信号通路的相关研究奠定基础。方法根据人notch1基因mRNA序列设计并合成两条互补的DNA单链寡核苷酸，将退火后形成的双链连接于pENTR/U6质粒，通过与pLenti6/BLOCKiTDEST载体的LR重组，构建notch1shRNA慢病毒表达载体，经脂质体介导入293FT细胞，包装成慢病毒。用该慢病毒感染人神经母细胞瘤系SHSY5Y细胞，RTPCR和Westernblot法检测细胞notch1基因的表

2、达。结果目的序列成功连接于载体并包装成较高滴度的慢病毒，细胞mRNA和蛋白质的检测均表明构建的notch1shRNA慢病毒表达载体LRNDA能显著抑制SHSY5Y细胞notch1基因的表达。结论成功构建人notch1shRNA慢病毒表达载体。【关键词】RNA基因表达慢病毒属遗传载体信号传导　　Notch信号通路与动物和人体的胚胎发育、细胞增殖和分化以及肿瘤的发生密切相关，Notch受体是一类由2753个氨基酸组成的跨膜受体，其同源分子包括Notchl～4。Notch通过与配体DSL(DeltaSerrateLag152)家族蛋白结合激活后，可开关细胞周期的

3、转换、调控细胞凋亡、生存命运的选择以及分化等，作为Notch信号通路的重要成分Notch1受体也就成为人们研究的重要靶点[12]。RNA干扰(RNAi)技术可高效、特异地下调靶基因的表达，是一种简便而快速的基因功能研究的手段[3]。慢病毒表达载体可有效地转染哺乳动物细胞，并能够整合于宿主细胞的基因组而较长期稳定地表达导入目的基因或片段，是理想的RNAi研究的表达载体。为了更好地进行Notch1信号通路与神经系统肿瘤关系和基因治疗的研究，本实验利用能够表达小干扰RNA的慢病毒载体，构建靶向notch1基因的表达小发卡RNA(shRNA)的慢病毒表达载体，为建立notch1

4、基因表达下调的细胞模型及其相关研究奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料BLOCKiTTM慢病毒RNAi表达系统、293FT细胞、大肠杆菌Top10、Stbl3化学感受态细菌、脂质体Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司);质粒抽提纯化试剂盒(荷兰QIAGEN公司，德国TIANGEN公司);TaqDNA聚合酶(美国Promega公司);DL2000DNAmarker(日本Takara公司);DMEM、PRMI1640培养基(美国Gibco公司);兔抗人Notch1抗体(美国Chemicon公司);小鼠抗人GAPDH抗体(美国SantaCruz

5、公司);辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗兔IgG、HRP兔抗小鼠IgG抗体和ECL化学发光试剂盒(美国CellSignaling公司)。人神经母细胞瘤系SH15SY5Y购自中科院上海细胞库。细胞寡核苷酸片段由南京金思科公司合成，PCR引物由上海Invitrogen英骏生物技术公司合成。其余试剂均为国产或进口分析纯。　　1.2方法　　1.2.1编码目的shRNA的单链DNA寡核苷酸片断的设计和合成根据GenBank中notch1基因mRNA序列(NM017617)，找出两条符合要求的靶序列：　　7745’CGACGATTGTCCAGGAAACAA3’794　

6、　22415’GACCAACTGTGACATCAACAA3’2261　　参照BLOCKiTTM慢病毒RNAi表达系统的要求，设计和合成两对针对靶序列和一对阴性对照的可形成茎环结构的正义链和反义链：　　notch1shRNA774:　　top链：5’caccGTTGTTTCCTGGACAATCGTCGcga　　aCGACGATTGTCCAGGAAACAA3’15　　bottom链：5’aaaaTTGTTTCCTGGACAATCGTCGtt　　cgCGACGATTGTCCAGGAAACAAC3’　　notch1shRNA2241:　　top链：5’

7、caccGTTGTTGATGTCACAGTTGGTCcg　　aaGACCAACTGTGACATCAACAA3’　　bottom链：5’aaaaTTGTTGATGTCACAGTTGGTC　　ttcgGACCAACTGTGACATCAACAAC3’　　阴性对照shRNA:　　top链：5’caccGTTCTCCGAACGTGTCACGTcgaaA　　CGTGACACGTTCGGAGAA3’　　bottom链：5’aaaaTTCTCCGAACGTGTCACGTttcg15　　ACGTGACACGTTCGGAGAAC3’