shrna lkb1慢病毒载体构建、转染和表达的研究

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1、分类号：密级：UDC：学号：416522612033南昌大学硕士研究生学位论文shRNALKB1慢病毒载体构建、转染和表达的研究Construction,transfectionandexpressionofletivirusshRNA-LKB1王小玉培养单位（院、系）：南昌大学第一附属医院指导教师姓名、职称：刘建英教授、主任医师申请学位的学科门类：医学学科专业名称：内科学（内分泌与代谢病）论文答辩日期：2015年6月答辩委员会主席：评阅人：2015年6月学位论文独创性声明一、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以

2、标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名（手写）：签字日期：年月日二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘

3、版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按“章程”规定享受相关权益。学位论文作者签名（手写）：导师签名（手写）：签字日期：年月日签字日期：年月日论文题目姓名学号论文级别博士□硕士□院/系/所专业备注：□公开□保密（向校学位办申请获批准为“保密”，年月后公开）I摘要摘要目的：构建针对人LKB1(liverkinaseB1，或STK11serine/threonineproteinkinase11)基因的特异性短发卡RNA（shorthairpinRNA,shRNA）表达的慢病毒载体，并观察转

4、染人肝癌细胞Huh7后对LKB1mRNA和蛋白的表达。方法：根据人LKB1的基因信息，设计3条针对LKB1基因cds区的siRNA序列，同时设计1条negative序列用于RNAi阴性对照（NegativeControl,NC），组建与shRNA相对应的4对互补的单链DNA。将合成的序列插入空载体GV115（元件顺序为：hU6-MCS-CMV-EGFP）中，重组获得慢病毒载体。进行测序鉴定后，再转染293T细胞产生病毒液，得到的病毒液再转染肝癌细胞株Huh7。荧光显微镜观察转染后细胞的情况，实时荧光定量PCR检测转染后细胞LKB1mRNA的表达情况，Western印迹法检测转染后细胞LKB1蛋

5、白的表达情况。结果：成功构建含shRNALKB1的慢病毒载体，人肝癌细胞株Huh7转染后LKB1mRNA和蛋白表达显著下调。结合感染后的细胞照片，判定shRNALKB1-2(KD2)组为有效靶点组。结论：成功获得阻断人肝癌细胞株Huh7LKB1表达的shRNA序列，并构建慢病毒载体，人肝癌细胞株Huh7转染后LKB1mRNA和蛋白表达显著下调，为后期研究提供了实验基础。关键词：shRNA；LKB1；人肝癌细胞IIAbstractABSTRACTObjective:ToconstructaspecificshorthairpinRNA(shRNA)expressingvectorsagainst

6、humanliverkinaseB1(LKB1)orserine/threonineproteinkinase11(STK11)geneandstudyitseffectofsilencingLKB1geneexpressionaftertransfectingthehepatoce-llularcarcinomaHuh7cells.Methods:ThreesiRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)sequencestargetingtheLKB1geneandonenegativesequencewhichwasusedasnegativecontrolgroupweredes

7、ignedandsynthesized,andthecorrespondingfourpairsofcomplementarysinglestrandDNAofshRNAwereformed.ThesyntheticshRNAsequencewasinsertedintotheemptyhU6-MCS-CMV-EGFPshRNAvector.Thentherecombinantlentivirus