nspc1-shrna慢病毒表达载体的构建与鉴定

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1、NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定李辉1，龚燕华2,3，胡光宇2（1．武警医学院组织胚胎学教研室，天津3001622．中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京1000053．武警医学院组织生物化学教研室，天津300162）摘要：目的构建并鉴定NSPc1-shRNA慢病毒表达载体，以便应用RNAi技术以及慢病毒感染系统进一步研究NSPc1的功能。方法设计针对NSPc1mRNA靶序列的小发夹状RNA，化学合成含茎环结构的正义链与反义链，退火形成带内切酶粘/平末端的双链后，与酶切后的pLentiLox3．7载体片

2、段进行连接、转化。用双酶切及DNA测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆质粒并转染293T细胞，收集细胞全蛋白用Western检测RNAi效果。结果重组克隆经酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体，DNA测序证实插入的序列正确，Western检测证实设计的三条RNA干扰序列有效敲低了293T细胞中的内源性NSPc1。结论三个NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用基于慢病毒系统的RNAi技术来研究NSPc1基因的功能打下了基础。关键词：RNA干扰；NSPc1；小发夹状RNA；慢病毒载体；多梳家族中图分类号：Q782文献标识码：AConst

3、ructionandidentificationoflentiviralvetorsexpressingshRNAofNSPc1geneLIHui1,GONGYan-hua2，3,HUGuang-yu2（1.DepartmentofHistologyandEmbryology，MedicalCollegeofChinesePeople'sArmedPoliceForce，Tianjin300162，China2．NationalLaboratoryofMedicineMolecularBiology,InstituteofBasicMedi

4、calSciences,CAMS,Beijing100005,China3．DepartmentofBiochemistry，MedicalCollegeofChinesePeople'sArmedPoliceForce，Tianjin300162，China）Abstract：ObjectiveToconstructandidentifythreelentiviralvectorstostudythefunctionofNSPc1usingRNAitechniqueandlentivirussystem．MethodsThreemRNAs

5、equencesofNSPc1werechosen，andthesmallhairpinRNAsequencesweredesigned．TheshRNAsequenceswereannealedandlinkedwithlinearizedpLentiLox3.7.TherecombinantswereidentifiedbydoublerestrictiondigestionandDNAsequencing.Theplasmidsofpositiveclonesweretransfectedinto293Tcells,andWester

6、nblotwasusedtoidentifytheRNAiefficiencyofthelentiviralvectors.ResultsThesmallhairpinRNAsequencesweresuccessfullyinsertedintopLentiLox3.7vector，andthesequenceswereidentifiedbyDNAsequencing．Further，westernblotvalidatedthatthethreesmallhairpinRNAscaneffectivelyknockdowntheexp

7、ressionlevelofendogenousNSPc1in293Tcells.ConclusionTheconstructionofsmallhairpinRNAexpressionvectorsofNSPc1genemakesthefurtherstudyoffunctionofNSPc1genepossibleusinglentivirussystem-basedRNAitechnique．Keywords：RNAinterference；NSPc1；smallhairpinRNA；lentivirusvector；Polycomb

8、Group【基金项目】国家自然科学基金面上项目（30971614），医学分子生物学国家重点实验室开放课题。【作者简介】李辉（1977－），女，湖北襄樊，汉族，硕士，助理研究员，主