人端粒酶逆转录酶基因shRNA慢病毒表达载体的构建及其病毒包装鉴定-论文.pdf

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1、580·中国妇幼保健2014年第29卷·实验与基础研究·人端粒酶逆转录酶基因shRNA慢病毒表达载体的构建及其病毒包装鉴定①莫小亮罗殿中②④莫凌昭③赵红珂②广西医科大学第一附属医院妇产科(广西南宁)530021中国图书分类号R737．33文献标识码B文章编号1001-4411(2014)04-0580-06；doi：10．7620／zgfybj．j．issn．1001—44l1．2014．04．37【摘要】目的：构建携带人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)慢病毒表达载体LV3一shRNA—hTERT及

2、其病毒包装鉴定并稳定转染宫颈癌Caski细胞系。方法：使用Designer3．0(Geuepharma)软件设计靶向hTERT的小发卡RNA(shRNA)序列，将hTERT—shRNA基因片段插入慢病毒载体pGLV3／H1／GFP+Puro中，构建慢病毒表达质粒LV3一shRNA—hTERT。通过酶切、DNA测序验证hTERT片段的准确性，将LV3一shRNA—hTERT与包装质粒共转染293T细胞，浓缩上清并测定病毒滴度获得重组慢病毒，将该重组慢病毒感染Caski细胞，通过观测绿色荧光蛋白(GFP

3、)的表达判断转染成功与否以及估计转染效率，RT—PCR、Westernblot分别测定转染后不同时间点的hTERTmRNA水平和hTERT蛋白表达情况，TRAP—ELISA法测定细胞端粒酶活性。结果：LV3一shRNA—hTERT携带正确hTERT基因，重组病毒经PCR证实hTERT—shRNA基因插入。利用重组慢病毒介导将重组质粒LV3一shRNA—hTERT高效转导入宫颈癌Caski细胞并稳定表达，荧光显微镜观察转染后24hCaski细胞即开始发出绿色荧光，72h后有大量荧光表达，而在稳定转染空

4、质粒的Caski细胞中不表达。检测转染后的Caski细胞，发现有3条链能明显抑制hTERTmRNA和蛋白水平的表达，并显著降低了细胞端粒酶活性，其中以72H～TERT一1515抑制作用最强，对hTERTm—RNA和蛋白的抑制率分别达75．0％和70．3％，端粒酶活性下降74．6％。结论：成功构建携带hTERT—shRNA慢病毒表达载体IV3一shRNA—hTERT，并稳定转染Caski细胞系，实验设计的shRNA能有效抑制宫颈癌Caski细胞hTERTmRNA水平和hTERT蛋白表达，并显著降低细胞

5、端粒酶活性。为端粒酶在宫颈癌发病机制的研究、宫颈癌基因治疗的体外干扰治疗奠定了工作基础。【关键词】宫颈癌人端粒酶逆转录酶基因小发卡RNA慢病毒载体Caski细胞Constructionandidentificationofhumantelomerasereversetranscriptase——targe．-tedsmallhairpinRNA—expressingplasmidanditsstabletransfectedcervicalcanc-erlineCaskiMOXiao—Liang，L

6、UODian—Zhong，MOLin—Zhao，eta1．TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniver—sty．Nanning530021，Guangxi，China[Abstract]Objective：Toconstructthehumantelomerasereversetranscriptase—targetedsmallhairpinRNA—expressingplasmid(hTERT～targetedshRNA—expressingp

7、lasmid)system，andtoobserveitseffectonhTERTexpressionandtelomeraseactivityincervicalcancercellsCaski．Methods：SequenceofhTERT—targetedshRNAwasdesignedbyDesigner3．0(Genepharma)basedonthemRNAse—quenceofhTERTwhichwasobtainedfromtheGenbank．Theywererecombined

8、withtheplasmidpGLV3／H1／GFP+Puro，andthenthoseplasmidswereidentifiedbygenesequencingtomakesuretheywerecorrectlyconnected．ThenthoseplasmidsweretransfectedintocervicalcancercellsCaskiandfluorescenceexpressionwasobserved．TheexpressionofhTERT