慢病毒载体的构建、改造及其包装细胞系的建立

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1、徐州医学院硕士学位论文慢病毒载体的构建、改造及其包装细胞系的建立姓名：李振宇申请学位级别：硕士专业：内科学(血液病)指导教师：徐开林;潘秀英20030401徐州医学院硕士学位论文慢病毒载体的构建、改造及其包装细胞系的建立研究生：李振宇导师：徐开林教授潘秀英教授摘要：目的①构建并改造来源于人类免疫缺陷病毒一l(HIV．1)的慢病毒载体三质粒包装系统，重点在转移质粒中引入多聚嘌呤通道序列元件(PPT)和选择不同的内部启动子来驱动标志基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达，完成其结构改造。②建立慢病毒载体的包装细胞系。③比较四种内部启动予驱动GFP表达的效率

2、，筛选出转导效率较高的内部启动子以建立一个转导效率较高的慢病毒载体。方法①载体的构建采用限制性内切酶酶切，T4DNA连接酶连接等方法。连接反应分为有插入子的连接组和无插入子的对照组，将连接产物转化感受态细菌，在连接板上挑取克隆提取质粒经限制性内切酶酶切鉴定，获得正向连接的质粒。②三质粒系统中，转移质粒分别含肝细胞特异性启动子，LSP；泛醌启动子，PUB；巨细胞病毒启动子，CMV：磷酸甘油酸激酶启动子，PGK。包装质粒为ANRF，内含CMV启动子和来自胰岛素基因的Poly(A)位点。包膜蛋白质粒编码水疱性VI炎病毒G糖蛋白，VSV．G。③载体构建成

3、功后，用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞一一293T，12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况。④转染后72小时收集病毒上清，采用6孔板培养感染细胞，荧光显微镜计数GFP阳性细胞法测定病毒滴度。结果徐州医学院硕士学位论文①成功构建了含PPT元件的质粒pXZI(PPT)，并在pXZI的基础之上构建了含上述肩动子和GFP的质粒pXZ2(LSP)、pXZ3(LSP+GFP)、pXZ4(PUB)、pXZ5(PUB+GFP)、pXZ6(PGK)、pXZ7(PGK+GFP)、pXZ8(CMV+GFP)。②转染293T细胞后12小时

4、在荧光显微镜下均观察到较强的绿色荧光，证实了GFP的表达，成功构建了慢病毒载体的三质粒系统，建立了慢病毒载体的包装细胞系。③转染72小时后，四种启动子驱动的GFP荧光强度均较12小时明显增强，在每一视野下，以CMV为启动予驱动的GFP表达的阳性包装细胞比例最高，达70％，在其他二种启动予驱动下，GFP表达阳性的包装细胞比例在30～50％之间。CMV启动予驱动下的GFP表达荧光亮度最强，LSP启动子荧光较弱，PGK和PUB启动子驱动下的GFP荧光强度接近，介于CMV和LSP之间。④以293T为靶细胞进行感染后，CMV为内部启动子的慢病毒载体滴度测定

5、在未进行超速离心浓缩的情况下达5×106IU／ml，含其他三种启动子的慢病毒载体的滴度也达到】～2×105IU／ml。四种内部启动子驱动下的GFP荧光强度与转染时相似，仍以CMV为内部启动子的慢病毒载体最强，LSP驱动者最弱。结论①成功构建了慢病毒载体的三质粒包装系统，完成了对转移质粒引入PPT元件和切换四种内部启动子的改造。②含四种启动子的质粒转染293T细胞后均获得了GFP的表达，完成了慢病毒载体包装细胞系的建立。③在对启动子效率进行比较时，筛选出转导效率较高的CMV启动子。建立了病毒滴度较高的慢病毒载体。关键词慢病毒载体；三质粒系统；293

6、T细胞；绿色荧光蛋白(GFP)助。本文受国家自然科学基金(编号：30170389)和江苏省“135”医学重点人才项目资堡丝垦兰堕堡主兰垒堡奎——Construetionandreformationofthelentiviralvectorsandestahlishmentofthepackagingeellline．Graduatestudent：Directedby：LiZhen—yuProf．XuKai．1inProf．PanXiu—yingA。bstactobjective：①Toconstructandreformthethree·pla

7、smidsystemoflentiviralvectorfromHumanImmunodeficiencyVirus．1(HIV-1)inwhichtheemphasiswasplacedonthereformationofthevectorplasmidbyinsertingthepolypurinepeptidetract(PPT)elementandchosingdifferentinternalpromoterstodrivetheexpressionofthemarkergenegreenflurosecentprotein(GFP)，

8、②Toestablishthepackagingcelllideforthelentiviralvectors．⑨Theefficien