大鼠fasl基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统的建立

《大鼠fasl基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、大鼠FasL基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统的建立：李望，孙晓青，胡书群，裴东生，陈波【关键词】基因表达　　摘要:目的建立真核细胞表达的大鼠FasL基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统，为进一步研究转FasL基因在同种异体器官移植中诱导免疫耐受、保护移植物的作用奠定基础。方法制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统:转移质粒（pLO134-FasL），包装质粒（ΔNRF）及包膜蛋白质粒（VSV-G）。脂质体法将三质粒共转染包装细胞293T，72h后收集病毒上清，ethodsThethree-plasmidrebinantlentiviralvector，adeup

2、ofthevectorplasmid（pLO134-FasL），thepackagingplasmid（ΔNRF）andtheenvelopplasmidencodingthevesicularstomatitisvirus-Gglycoprotein（VSV-G），anembryonickidney293Tcellsidsbylipofectamine2000.After72hoursoftransfection，theviralsupernatantethod.ResultFasLproteinidpackagingcelllinesystemofrebin

3、antlentiviralvectorine2000、胎牛血清、DMEM、琼脂粉、LB琼脂购自Invitrogen公司;鼠FasL单克隆抗体为Santacruz公司产品，羊抗兔IgG-AP为Sigma公司产品;NBT.BCIP购自Promega公司，硝酸纤维膜（NC）、牛血清白蛋白（组分V）购自Amresco公司;其他常用试剂均为国产分析纯试剂。　　1.1.2质粒与包装细胞重组慢病毒载体转移质粒pLO134-FasL由本研究室构建并贮存;包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSV-G由徐州医学院血液病研究中心徐开林教授惠赠;包装细胞293T由徐州医学院分子生物学中心提

4、供。　　1.2方法　　1.2.1三质粒的中量制备分别将含有重组转移质粒pLO134-FasL、空白转移质粒pLO134、包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSV-G的冻存菌接种于100ml含氨苄青霉素的LB培养基过夜培养;收集细菌沉淀后，参照中量DNA纯化制备试剂盒（Invitro-genS.N.A.P.MidiprepKit）说明进行质粒的纯化制备;纯化产物经紫外光栅分光仪测定各质粒浓度。　　1.2.2293T细胞转染选择生长状态良好的293T细胞进行传代培养，当细胞生长达70%融合时，弃培养基并以无抗无血清DMEM培养基冲洗;将20μl脂质体Lipofectam

5、ine2000加至500μl的无抗无血清的DMEM培养基，充分振荡后快速加入重组质粒pLO134-FasL15μg、ΔNRF10μg、VSV-G5μg，静置20min移至293T细胞培养瓶中培养;4h后更换完全培养基培养，72h后收集病毒上清并贮存。同样方法作空白质粒pLO134、ΔNRF、VSV-G的293T细胞转染，用于对照。　　1.2.3A行SDS-PAGE凝胶电泳样品，当蓝色条带消失时半干法转移凝胶至硝酸纤维素膜（NC），40min后封闭硝酸纤维素膜并以摇床慢摇4h;冲洗后加入鼠FasL单克隆抗体，慢摇30min，4℃过夜;加入酶标羊抗兔IgG-AP，慢

6、摇2h后进行显色处理，待显影满意立刻用清水冲洗终止反应，UVP扫描摄像。　　2结果　　2.1三质粒浓度测定中量纯化制备慢病毒载体三质粒系统，纯化产物经紫外光栅分光仪测定各质粒浓度:重组转移质粒pLO134-FasL为150mg.L，空白转移质粒pLO134为180mg.L，包装质粒ΔNRF为80mg.L，包膜蛋白质粒VSV-G为50mg.L。符合包装细胞转染要求。　　2.2293T细胞FasL表达转染慢病毒重组载体和空白载体后的293T细胞同一条件下行Western-blot蛋白检测。电泳及显色处理后，转染重组载体的293T细胞所表达蛋白能与鼠FasL单克隆抗体

7、特异结合，在硝酸纤维膜上有明显的免疫印迹条带，而空白载体组条带极微弱（图1）。　　图1Western-blot检测293T细胞FasL表达（略）　　3讨论　　同种异体排斥反应是制约人类器官移植发展的主要障碍。目前，临床普遍应用免疫抑制剂来对抗宿主对移植物的排斥，但其价格昂贵，并存在明显的毒副作用，易导致感染、器官损害和肿瘤的发生，且该类药物本身对移植物亦造成伤害。因此寻找新的有效的治疗方法预防同种异体排斥反应成为移植界亟待解决的问题［1］。目前利用转基因技术将FasL基因转染靶细胞以表达外源性功能蛋白FasL，籍此诱导宿主的免疫耐受，延长移植物存活，并可望在此方

8、面取得突破。　　Swen