大鼠fasl基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统的建立论文

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1、大鼠FasL基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统的建立论文.freelidpackagingcelllineoftherebinantlentiviralvectorencodingratFasLgeneforeukaryoticexpressiontomeettherequisitionfordeepstudyontheeffectofFasLtransgeneoninducingimmunetoleranceandprotectingallograftsinorganictransplantation.MethodsThethree-

2、plasmidrebinantlentiviralvector，adeupofthevectorplasmid（pLO134-FasL），thepackagingplasmid（ΔNRF）andtheenvelopplasmidencodingthevesicularstomatitisvirus-Gglycoprotein（VSV-G），anembryonickidney293Tcellsidsbylipofectamine2000.After72hoursoftransfection，theviralsupernatantethod.

3、ResultFasLproteinidpackagingcelllinesystemofrebinantlentiviralvectorine2000、胎牛血清、DMEM、琼脂粉、LB琼脂购自Invitrogen公司;鼠FasL单克隆抗体为Santacruz公司产品，羊抗兔IgG-AP为Sigma公司产品;NBT.BCIP购自Promega公司，硝酸纤维膜（NC）、牛血清白蛋白（组分V）购自Amresco公司;其他常用试剂均为国产分析纯试剂。1.1.2质粒与包装细胞重组慢病毒载体转移质粒pLO134-FasL由本研究室构建并贮存;包装质粒

4、ΔNRF、包膜蛋白质粒VSV-G由徐州医学院血液病研究中心徐开林教授惠赠;包装细胞293T由徐州医学院分子生物学中心提供。1.2方法1.2.1三质粒的中量制备分别将含有重组转移质粒pLO134-FasL、空白转移质粒pLO134、包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSV-G的冻存菌接种于100ml含氨苄青霉素的LB培养基过夜培养;收集细菌沉淀后，参照中量DNA纯化制备试剂盒（Invitro-genS.N.A.P.MidiprepKit）说明进行质粒的纯化制备;纯化产物经紫外光栅分光仪测定各质粒浓度。1.2.2293T细胞转染选择生长状态良好的

5、293T细胞进行传代培养，当细胞生长达70%融合时，弃培养基并以无抗无血清DMEM培养基冲洗;将20μl脂质体Lipofectamine2000加至500μl的无抗无血清的DMEM培养基，充分振荡后快速加入重组质粒pLO134-FasL15μg、ΔNRF10μg、VSV-G5μg，静置20min移至293T细胞培养瓶中培养;4h后更换完全培养基培养，72h后收集病毒上清并贮存。同样方法作空白质粒pLO134、ΔNRF、VSV-G的293T细胞转染，用于对照。1.2.3，etal.Anexperimentalstudyoninduce-me

6、ntofratlivertransplantationtolerancebyconstructingretroviralvec-torcontainingFasLgene［J］.ChinJHepatobilSurg，2002，8（5）:294-296.［5］NaldiniL，BlomerU，GageFH，etal.Efficienttransfer，intgration，andsustainedlong-termexpressionofthetransgeneinadultratbrainsinjectederU，PetersonDA，e

7、tal.Sustainedexpressionofgenedelivereddirectlyintoliverandmusclebylentiviralvectors［J］.NatGe，1997，17（3）:314-317.［7］BuchschacherGLJr，J，PlantGedi-atedgeneexpressioninolfactoryensheathinggliaimplantsinthele-sionedratspinalcord［J］.GeneTher，2002，9（2）:135-146.