hTERT shRNA表达质粒的构建及鉴定.doc

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1、hTERTshRNA表达质粒的构建及鉴定[摘要]目的构建针对人端粒酶催化亚基hTERT的shRNA表达质粒并加以鉴定。方法以具有G418抗性的pBAsi-hU6-Neo（〃臼加1/〃力方山）质粒构建针对hTERT的shRNA表达载体，应用基因测序加以验证。经脂质体转染shRNA质粒入乳腺癌T47D细胞，抗生素G418筛选转染成功的细胞株。采用半定量RT-PCR及westernblot法检测细胞屮hTERT在mRNA和蛋白质水平上的表达；TRAP-ELTSA法检测细胞的端粒酶活性变化。结果成功构建了

2、5种针对hTERT的shRNA质粒，经测序验证无误。将质粒转染入T47D细胞后经G418筛选获得了稳定转染的细胞株，hTERT基因在mRNA和蛋口水平的表达明显降低，端粒酶活性显著下降。结论质粒pBAsi-hU6-Neo（〃滋HI/〃力dill）可用于构建hTERTshRNA表达载体，可转染到乳腺癌T47D细胞，并能显著降低hTERT基因mRNA和蛋白的表达，进而抑制细胞端粒酶活性。[主题词]端粒酶；人端粒酶逆转录酶；RA干扰；乳腺癌Constructionandidentificationof

3、hTER'PtargetedshRNA-expressingplasmidHUFan-guo,SHIYu-rong,NIURui-fang,LIUTong,ZHIXiang-chengAbstract[Objective]ToconstructandidentifyahTERT-targetedshRNA-expressingplasmidvector.[Method]TheplasmidpBAsi-hU6-Neo（BamUl/HindUI）whichisimmunetoantibioticG41

4、8wasusedtoconstructshRNA-expressingvectorandidentifiedbygenesequencing.PlasmidwastransfectedintobreastcancercellT47DwithliposomeandthosecellsexpressingshRNAwereselectedbyG4I8.RT-PCRandwesternblotwereusedtodetecttheexpressionofhTERTonmRNAandproteinleve

5、l.ThetelomeraseactivitywasexaminedbyTRAP-ELISA.[Results]5kindsofhTERT-targetedshRNA-expressingplasmidweresuccessfullyconstructed,whichwasprovedbygenesequencing,andtheywereintroducedintobreastcancercellT47D.TheexpressionofhTERTdecreasedbothonmRNAandpro

6、teinlevel,andtelomeraseactivitywasinhibitedatthesametime.[Conclusion]TheplasmidpBAsi-hU6-Neo(BamHUHindIII)canbeusedtoconstructshRNA-expressingvectorandtransfectedintobreastcancercellT47D.TheshRNA-targetedhTERl^expressingvectorcaninhibittheexpressionof

7、hTERTonbothmRNAandproteinlevelandthenreducethetelomeraseactivity.[keywordsltelomerase;hTERT;RNAi;breastcancer端粒酶的活化与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，通过激活端粒酶，端粒DNA得以延长从而使细胞获得永生化。端粒酶逆转录酶(telomeTdsereversetranscriptase,TERT)是端粒酶的活性亚基,一般只在永生化细胞中表达“,抑制其表达可明显降低细胞端粒酶活性2。RXA干扰

8、技术(RXAinterference,RNAi)通过双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)产生序列特异性的转录后基因沉默，在哺乳动物细胞内可高效特异地阻断特定基因的表达⑶，其沉默效果具有高效、特异、持久等特点，现已作为一种成熟的技术广泛应用于基因的沉默研究。本研究拟构建针对人端粒酶催化亚基hTERT的短发夹状RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表达质粒，使其在乳腺癌细胞T47D屮稳定表达特异性shRXA,检测其对hTERT基因表达和端粒酶活性的