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时间:2018-07-15
《htertshrna表达质粒的构建及鉴定》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、hTERTshRNA表达质粒的构建及鉴定胡凡果1,史玉荣2,牛瑞芳2,刘彤1,只向成3(1天津医科大学总医院普通外科300000;2天津医科大学附属肿瘤医院中心实验室300000;3天津医科大学附属肿瘤医院乳腺三科300000)通讯作者:只向成doctorx888@sina.com[摘要]目的构建针对人端粒酶催化亚基hTERT的shRNA表达质粒并加以鉴定。方法以具有G418抗性的pBAsi-hU6-Neo(BamHI/HindⅢ)质粒构建针对hTERT的shRNA表达载体,应用基因测序加以验证。经脂质体转染shRNA质粒入乳腺癌T47D细胞,抗生素G418筛选转染成功的细胞株。
2、采用半定量RT-PCR及westernblot法检测细胞中hTERT在mRNA和蛋白质水平上的表达;TRAP-ELISA法检测细胞的端粒酶活性变化。结果成功构建了5种针对hTERT的shRNA质粒,经测序验证无误。将质粒转染入T47D细胞后经G418筛选获得了稳定转染的细胞株,hTERT基因在mRNA和蛋白水平的表达明显降低,端粒酶活性出现显著下降。结论质粒pBAsi-hU6-Neo(BamHI/HindⅢ)可用于构建hTERTshRNA表达载体,可转染到乳腺癌T47D细胞,并能显著降低hTERT基因mRNA和蛋白的表达,进而抑制细胞端粒酶活性不精炼。[主题词]端粒酶;人端粒酶逆
3、转录酶;RNA干扰;乳腺癌ConstructionandidentificationofhTERT-targetedshRNA-expressingplasmidHUFan-guo,SHIYu-rong,NIURui-fang,LIUTong,ZHIXiang-chengAbstract[Objective]ToconstructandidentifyahTERT-targetedshRNA-expressingplasmidvector.[Method]TheplasmidpBAsi-hU6-Neo(BamHI/HindⅢ)whichisimmunetoantibioticG4
4、18wasusedtoconstructshRNA-expressingvectorandidentifiedbygenesequencing.PlasmidwastransfectedintobreastcancercellT47DwithliposomeandthosecellsexpressingshRNAwereselectedbyG418.RT-PCRandwesternblotwereusedtodetecttheexpressionofhTERTonmRNAandproteinlevel.ThetelomeraseactivitywasexaminedbyTRAP-
5、ELISA.[Results]5kindsofhTERT-targetedshRNA-expressingplasmidweresuccessfullyconstructed,whichwasprovedbygenesequencing,andtheywereintroducedintobreastcancercellT47D.TheexpressionofhTERTdecreasedbothonmRNAandproteinlevel,andtelomeraseactivitywasinhibitedatthesametime.[Conclusion]TheplasmidpBAs
6、i-hU6-Neo(BamHI/HindⅢ)canbeusedtoconstructshRNA-expressingvectorandtransfectedintobreastcancercellT47D.TheshRNA-targetedhTERT-expressingvectorcaninhibittheexpressionofhTERTonbothmRNAandproteinlevelandthenreducethetelomeraseactivity.[keywords]telomerase;hTERT;RNAi;breastcancer端粒酶的活化与恶性肿瘤的发生、发展
7、密切相关,通过激活端粒酶,端粒DNA得以延长从而使细胞获得永生化。端粒酶逆转录酶(telomerasereversetranscriptase,TERT)是端粒酶的活性亚基,一般只在永生化细胞中表达[1],抑制其表达可明显降低细胞端粒酶活性[2]。RNA干扰技术(RNAinterference,RNAi)通过双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)产生序列特异性的转录后基因沉默,在哺乳动物细胞内可高效特异地阻断特定基因的表达[3],其沉默效果具有高效、特异、持
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