htertshrna表达质粒的构建及鉴定

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1、hTERTshRNA表达质粒的构建及鉴定胡凡果1，史玉荣2，牛瑞芳2，刘彤1，只向成3（1天津医科大学总医院普通外科300000；2天津医科大学附属肿瘤医院中心实验室300000；3天津医科大学附属肿瘤医院乳腺三科300000）通讯作者：只向成doctorx888@sina.com[摘要]目的构建针对人端粒酶催化亚基hTERT的shRNA表达质粒并加以鉴定。方法以具有G418抗性的pBAsi-hU6-Neo（BamHI/HindⅢ）质粒构建针对hTERT的shRNA表达载体，应用基因测序加以验证。经脂质体转染shRNA质粒入乳腺癌T47D细胞，抗生素G418筛选转染成功的细胞株。采用半定量R

2、T-PCR及westernblot法检测细胞中hTERT在mRNA和蛋白质水平上的表达；TRAP-ELISA法检测细胞的端粒酶活性变化。结果成功构建了5种针对hTERT的shRNA质粒，经测序验证无误。将质粒转染入T47D细胞后经G418筛选获得了稳定转染的细胞株，hTERT基因在mRNA和蛋白水平的表达明显降低，端粒酶活性出现显著下降。结论质粒pBAsi-hU6-Neo（BamHI/HindⅢ）可用于构建hTERTshRNA表达载体,可转染到乳腺癌T47D细胞，并能显著降低hTERT基因mRNA和蛋白的表达，进而抑制细胞端粒酶活性不精炼。[主题词]端粒酶；人端粒酶逆转录酶；RNA干扰；乳腺

3、癌ConstructionandidentificationofhTERT-targetedshRNA-expressingplasmidHUFan-guo,SHIYu-rong,NIURui-fang,LIUTong,ZHIXiang-chengAbstract[Objective]ToconstructandidentifyahTERT-targetedshRNA-expressingplasmidvector.[Method]TheplasmidpBAsi-hU6-Neo（BamHI/HindⅢ）whichisimmunetoantibioticG418wasusedtoconstru

4、ctshRNA-expressingvectorandidentifiedbygenesequencing.PlasmidwastransfectedintobreastcancercellT47DwithliposomeandthosecellsexpressingshRNAwereselectedbyG418.RT-PCRandwesternblotwereusedtodetecttheexpressionofhTERTonmRNAandproteinlevel.ThetelomeraseactivitywasexaminedbyTRAP-ELISA.[Results]5kindsofh

5、TERT-targetedshRNA-expressingplasmidweresuccessfullyconstructed,whichwasprovedbygenesequencing,andtheywereintroducedintobreastcancercellT47D.TheexpressionofhTERTdecreasedbothonmRNAandproteinlevel,andtelomeraseactivitywasinhibitedatthesametime.[Conclusion]TheplasmidpBAsi-hU6-Neo（BamHI/HindⅢ）canbeuse

6、dtoconstructshRNA-expressingvectorandtransfectedintobreastcancercellT47D.TheshRNA-targetedhTERT-expressingvectorcaninhibittheexpressionofhTERTonbothmRNAandproteinlevelandthenreducethetelomeraseactivity.[keywords]telomerase;hTERT;RNAi;breastcancer端粒酶的活化与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，通过激活端粒酶，端粒DNA得以延长从而使细胞获得永生化。端粒酶

7、逆转录酶（telomerasereversetranscriptase,TERT）是端粒酶的活性亚基，一般只在永生化细胞中表达[1]，抑制其表达可明显降低细胞端粒酶活性[2]。RNA干扰技术（RNAinterference,RNAi）通过双链RNA（doublestrandedRNA，dsRNA）产生序列特异性的转录后基因沉默，在哺乳动物细胞内可高效特异地阻断特定基因的表达[3]，其沉默效果具有高效、特异、持