小鼠cd40ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

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1、小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定【摘要】目的:构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法:以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2aFc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果:成功构建了小鼠

2、CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论:小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。【关键词】CD40Ig质粒真核表达载体Abstract:Objective:ToconstructaeukaryoticexpressionvectorencodingmurineCD40Iggeneandmakepreparationforthegenetherapyofinductionofdonor-

3、specificimmunologictolerance.Methods:ThecDNAoftheextracellulardomainofmurineCD40geneandIgG2aFcgeneplifiedbyRT-PCRfromthetotalRNAisolatedfromthemousespleen,andthegreenfluorescentprotEin(GFP)geneplifiedbyPCRidpEGFP-N1asthetemplate.Thenthegenesidedbyseqencing.Thentherebinan

4、tplasmidanembryonickidneycell293(HEK293)usingLipofectamine2000,theexpressedfusionprotEInicroscopy.Results:TheeukaryoticexpressionplasmidpDC516-CD40-IgG-GFPidpDC516-CD40-IgG-GFPhaslaidthefoundationforthestudyofinductionofdonor-specificimmunologictolerance.Keyid;eukaryotic

5、expressionvector器官移植是当今治疗终末期脏器衰竭的有效方法，但免疫排斥是器官移植后长期生存的一大难题。T细胞是介导排异反应的主要细胞，CD40/CD40L通路在T细胞的激活过程中发挥着重要作用，因此阻断CD40/CD40L间的相互作用，可以诱导宿主对移植物的低排斥反应性。由此我们克隆了小鼠CD40分子胞外区和IgG2a分子Fc段的cDNA，并以pEGFP-N1质粒为模板进行PCR，获得GFP基因，经酶切连接插入真核表达载体pDC516，制备出重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，转染293细胞后见GFP表达，证

6、实质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，从而为下一步构建含CD40Ig基因的腺病毒载体作好了准备，为研究阻断CD40/CD40L通路诱导宿主对移植物的低排斥反应性奠定了基础。1材料和方法1.1实验动物Balb-c小鼠，6周龄,雌性,购自北京大学医学院实验动物部。1.2质粒、菌株、细胞株和主要试剂质粒pEGFP-N1、pGEM-T载体质粒、Ecoli.DH5a（天根公司）。低代次HEK293细胞株（本元正阳）。AdMaxTMKitE试剂盒（MicrobixBiosystems，Inc.）。Taq酶、T4DNA连接酶（Taka

7、ra公司）。限制性核酸内切酶XmaⅠ、BglII、HindIII（Biolabs）。Trizol试剂、Lipofectamine2000（Invitrogen）。逆转录试剂盒、PCRMasterMix（MBI）。质粒提取、胶纯化试剂盒（QIAGEN）。DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰酶（Gibco）。引物合成由上海生工公司完成，基因测序由北京诺塞基因研究中心有限公司完成。1.3构建小鼠CD40Ig基因真核表达质粒1.3.1小鼠脾脏总RNA的提取：将小鼠以颈椎脱臼法处死，取出脾脏，加入液氮研磨后，用Trizol试剂提取总RNA，方法按产品

8、说明进行。1.3.2CD40、IgG2aFc、GFP基因的制备：以小鼠脾脏总RNA为模板，oligo-dT为引物，RT-PCR合成cDNA，再以此cDNA为模板，用CD40和mIgGFc特异引物进行PCR扩