小鼠cd40ig基因真核表达质粒的构建及鉴定论文

《小鼠cd40ig基因真核表达质粒的构建及鉴定论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定论文【摘要】目的:构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法:以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2aFc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观

2、察融合蛋白的表达。结果:成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论:小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。【关键词】CD40Ig质粒真核表达载体Abstract:Objective:ToconstructaeukaryoticexpressionvectorencodingmurineCD40Iggeneandmakepreparation

3、forthegenetherapyofinductionofdonor-specificimmunologictolerance.Methods:ThecDNAoftheextracellulardomainofmurineCD40geneandIgG2aFcgeneplifiedbyRT-PCRfromthetotalRNAisolatedfromthemousespleen,andthegreenfluorescentprotein(GFP)geneplifiedbyPCRidpEGFP-N1ast

4、hetemplate.Thenthegenesidedbyseqencing.Thentherebinantplasmidanembryonickidneycell293(HEK293)usingLipofectamine2000,theexpressedfusionproteinicroscopy.Results:TheeukaryoticexpressionplasmidpDC516-CD40-IgG-GFPidpDC516-CD40-IgG-GFPhaslaidthefoundationforth

5、estudyofinductionofdonor-specificimmunologictolerance.Keyid;eukaryoticexpressionvector器官移植是当今治疗终末期脏器衰竭的有效方法.freels，Inc.）。Taq酶、T4DNA连接酶（Takara公司）。限制性核酸内切酶XmaⅠ、BglII、HindIII（Biolabs）。Trizol试剂、Lipofectamine2000（Invitrogen）。逆转录试剂盒、PCRMasterMix（MBI）。质粒提取、胶纯化试

6、剂盒（QIAGEN）。DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰酶（Gibco）。引物合成由上海生工公司完成，基因测序由北京诺塞基因研究中心有限公司完成。1.3构建小鼠CD40Ig基因真核表达质粒1.3.1小鼠脾脏总RNA的提取：将小鼠以颈椎脱臼法处死，取出脾脏，加入液氮研磨后，用Trizol试剂提取总RNA，方法按产品说明进行。1.3.2CD40、IgG2aFc、GFP基因的制备：以小鼠脾脏总RNA为模板，oligo-dT为引物，RT-PCR合成cDNA，再以此cDNA为模板，用CD40和mIgGFc特异引物进

7、行PCR扩增，另以pEGFP-N1质粒为模板进行PCR扩增，引物及PCR反应条件见表1，分别获得CD40、mIgG2aFc和GFP基因。1.3.3质粒pGEM-IgG的构建：将IgGFc的PCR产物与pGEM-T质粒进行TA连接反应，即10μlPCR产物加2μl的pGEM-T载体加10U的T4连接酶，16℃过夜。取2μl的连接产物以氯化钙法转化大肠杆菌DH5α，用蓝白斑方法挑选含氨苄青霉素抗性的白斑克隆，在3mlLB培养基（含氨苄青霉素100μg/ml）中37℃、80r/min振荡培养过夜，提取质粒pG

8、EM-IgG并测序。1.3.4质粒p516-IgG的构建：用BglII分别消化pGEM-IgG和pDC516，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后进行胶纯化。将IgG片段和pDC516线性载体按7:1的摩尔浓度比例加T4连接酶16℃过夜进行连接反应。取5μl连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，用pDC516-f和mIgG-r引物组合进行菌落PCR筛选正向插入的重组子（见表2），将PCR阳性的重组子进行细菌培养，提取质粒并测序。1.3.5质粒p51