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时间:2018-07-10
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1、小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定论文【摘要】目的:构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体,为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法:以小鼠脾脏总RNA为模板,以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2aFc段cDNA;另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白(GFP)基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP,测序鉴定正确后,用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞(HEK293细胞),荧光显微镜下观
2、察融合蛋白的表达。结果:成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP,并在HEK293细胞中实现表达。结论:小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功,为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。【关键词】CD40Ig质粒真核表达载体Abstract:Objective:ToconstructaeukaryoticexpressionvectorencodingmurineCD40Iggeneandmakepreparation
3、forthegenetherapyofinductionofdonor-specificimmunologictolerance.Methods:ThecDNAoftheextracellulardomainofmurineCD40geneandIgG2aFcgeneplifiedbyRT-PCRfromthetotalRNAisolatedfromthemousespleen,andthegreenfluorescentprotein(GFP)geneplifiedbyPCRidpEGFP-N1ast
4、hetemplate.Thenthegenesidedbyseqencing.Thentherebinantplasmidanembryonickidneycell293(HEK293)usingLipofectamine2000,theexpressedfusionproteinicroscopy.Results:TheeukaryoticexpressionplasmidpDC516-CD40-IgG-GFPidpDC516-CD40-IgG-GFPhaslaidthefoundationforth
5、estudyofinductionofdonor-specificimmunologictolerance.Keyid;eukaryoticexpressionvector器官移植是当今治疗终末期脏器衰竭的有效方法.freels,Inc.)。Taq酶、T4DNA连接酶(Takara公司)。限制性核酸内切酶XmaⅠ、BglII、HindIII(Biolabs)。Trizol试剂、Lipofectamine2000(Invitrogen)。逆转录试剂盒、PCRMasterMix(MBI)。质粒提取、胶纯化试
6、剂盒(QIAGEN)。DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰酶(Gibco)。引物合成由上海生工公司完成,基因测序由北京诺塞基因研究中心有限公司完成。1.3构建小鼠CD40Ig基因真核表达质粒1.3.1小鼠脾脏总RNA的提取:将小鼠以颈椎脱臼法处死,取出脾脏,加入液氮研磨后,用Trizol试剂提取总RNA,方法按产品说明进行。1.3.2CD40、IgG2aFc、GFP基因的制备:以小鼠脾脏总RNA为模板,oligo-dT为引物,RT-PCR合成cDNA,再以此cDNA为模板,用CD40和mIgGFc特异引物进
7、行PCR扩增,另以pEGFP-N1质粒为模板进行PCR扩增,引物及PCR反应条件见表1,分别获得CD40、mIgG2aFc和GFP基因。1.3.3质粒pGEM-IgG的构建:将IgGFc的PCR产物与pGEM-T质粒进行TA连接反应,即10μlPCR产物加2μl的pGEM-T载体加10U的T4连接酶,16℃过夜。取2μl的连接产物以氯化钙法转化大肠杆菌DH5α,用蓝白斑方法挑选含氨苄青霉素抗性的白斑克隆,在3mlLB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中37℃、80r/min振荡培养过夜,提取质粒pG
8、EM-IgG并测序。1.3.4质粒p516-IgG的构建:用BglII分别消化pGEM-IgG和pDC516,产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后进行胶纯化。将IgG片段和pDC516线性载体按7:1的摩尔浓度比例加T4连接酶16℃过夜进行连接反应。取5μl连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,用pDC516-f和mIgG-r引物组合进行菌落PCR筛选正向插入的重组子(见表2),将PCR阳性的重组子进行细菌培养,提取质粒并测序。1.3.5质粒p51
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