小鼠真核表达质粒pcdna3.1(+)fgfr1的构建及表达

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1、小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)FGFR1的构建及表达作者：郭峻莉，翁志宏，郑少江【摘要】目的：通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)FGFR1，并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞，Westernblot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果：经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR

2、1目的蛋白。结论：成功构建的pcDNA3.1(+)FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。【关键词】碱性成纤维细胞生长因子1型受体(FGFR1);真核表达质粒;基因工程　　Viewfromspecialist:Itiscreative,andofcertainscientificandeducationalvalue.　　[ABSTRACT]Objective:ToconstructarecombinanteukaryoticexpressionplasmidpcDNA3.1(+)FGFR1,anddetect9itse

3、xpressioninthecellofCHO.Methods:ThefulllengthgeneofmurineFGFR1wasamplificatedbyPCR,andthenwasinsertedintotheeukaryoticexpressionplasmidpcDNA3.1(+).Aftertherecombinantplasmidwasconfirmedbyrestrictionendonucleaseanalysedandsequencingtest,itwastransfectedintoeukaryoticcel

4、lCHObylipofectin.TheFGFR1proteinwasexploredbyWesternblot.Results:TheconstructedrecombinantplasmidcontainedthesequenceofFGFR1gene.Aftertransfectionwiththeplasmid,FGFR1proteincanbeexpressedinCHOcells.Conclusion:TheconstructedeukaryoticexpressionplasmidpcDNA3.1(+)FGFR1can

5、effectivelyexpressFGFR1proteininvitro.　　[KEYWORDS]Fibroblastgrowthfactorreceptor1(FGFR1);Eukaryoticexpressionplasmid;Geneticengineering　　现已证实，实体肿瘤的生长与转移必须依赖于血管生成[1,2]。碱性成纤维细胞生长因子1型受体(fibroblastgrowthfactorreceptor1，FGFR1)是最重要的肿瘤血管生成调节因子之一，其主要通过与高亲和性配体bFGF结合后发生二聚体化导致自身磷

6、酸化，从而诱导肿瘤血管生成，进而促使肿瘤细胞增生和转移[3-5]。可见，FGFR91/bFGF信号传导通路在肿瘤血管生成中扮演着重要作用。许多研究表明，利用DNA核酸疫苗可以诱导产生交叉免疫反应抗肿瘤血管生成[6-8]。我们新近研究也证实，以FGFR1基因为靶点的生物治疗可以抑制肿瘤血管生成达到治疗肿瘤的目的[9-11]。因此，本研究拟利用基因工程技术构建小鼠FGFR1真核表达载体，为后继研究FGFR1的医学应用奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1质粒和宿主菌真核表达质粒pcDNA3.1(+)购自Invitrog

7、en公司，宿主大肠埃希杆菌E.coliDH5α和CHO细胞株为本实验室保存。　　1.1.2酶类及试剂Trizol、转染试剂盒LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，一步法RTPCR试剂盒、DNAmarker、限制性内切酶和T4噬菌体DNA连接酶购自TaKaRa公司，胎牛血清购自Gibcol公司，辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG购自SantaCruz公司。　　1.2方法　　1.2.1目的基因片段的体外扩增9根据GenBank中小鼠FGFR1基因全序列设计扩增其全长基因序列的引物。经引物设计软件Oligo6

8、.0评价，设计的引物符合要求，没有破坏FGFR1基因的阅读框架。上游引物：5′ATATGTGGGGATGGAAGTGCCTC3′，下游引物：5′AATCAGCGCCGTTTGAGTCCAC3′，引物由上海基康生物