mgitrl真核表达质粒的构建及其在lewis细胞中的表达

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1、mGITRL真核表达质粒的构建及其在Lewis细胞中的表达【摘要】目的：构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL，体外转染小鼠肺癌细胞株Lewis细胞。方法：利用PCR方法扩增mGITRL基因，克隆至pIRES2-eGFP载体，选择阳性克隆并进行序列测定。以电穿孔法转染Lewis细胞，通过G418筛选，获得稳定表达细胞株。结果：构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL，基因测序与GenBank中发表的序列完全一致，体外转染Lewis细胞，经G418筛选，体外传代30代以上，RT-PCR及流式细胞仪检测该细胞株稳定表达mGITRL

2、。结论：成功构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL，并在小鼠Lewis细胞中稳定表达，为进一步研究GITRL的生物学功能提供研究基础。【关键词】GITRL；细胞转染；肿瘤　　［Abstract］Objective:ToconstructeukaryoticexpressionvectorcontainingmGITRLgenepIRES2-eGFP/mGITRLandtransfectitintoLewiscell.Methods：ThemGITRLgenewasamplifiedfromintermediatevectorPMD18-T/mGITRLbyPC

3、RandinsertedintopIRES2-eGFPvector,andthesequenceofDNAwasanalyzed.ThemGITRLgenewastransfectedintoLewiscellbyelectroporationandthepositiveclonewasselectedbyG418.12Results：ExpressionplasmidpIRES2-eGFP/mGITRLwassuccessfullyconstructed,sharing100%homologywiththesequenceofmRNAformGITRLinGenBank.m

4、GITRLgeneandtheproteincouldbedetectedbyRT-PCRandFCMinthetransfectedLewiscell.Conclusion：pIRES2-eGFP/mGITRLvectorhasbeenconstructedsuccessfullyandwasexpressedstablyinLewiscell,whichbroughtafoundationforfurtherresearchingonitsbiologicalfunction.　　［Keywords］glucocorticoid-inducedtumornecrosisf

5、actorreceptorligand；celltransfection；tumor　　肿瘤严重危害人类健康，免疫治疗已成为肿瘤治疗的重要手段。研究发现调节性T细胞抑制效应性T细胞，在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用，体内清除调节性T细胞则有利于抗肿瘤免疫应答［1］。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-inducedtumornecrosisfactorreceptor，GITR）是胸腺来源的CD4+CD25+调节性T细胞（regulatoryTcell，Treg）的重要表面标志，其配体（GITRligand,GITRL）具有解除Treg免疫抑制功能

6、的作用［2］。本研究构建pIRES2-eGFP/mGITRL真核表达质粒，体外转染小鼠肺癌细胞株Lewis细胞，为进一步研究GITRL的生物学功能提供研究基础。12　　1材料与方法　　1.1材料　　RPMI1640（Gibco公司），新生小牛血清（兰州民海生物有限公司），PE标记anti-mGITRL（eBioscience公司），Trizol及逆转录试剂盒（Invitrogene公司），DNA聚合酶，dNTP，EcoRⅠ及SalⅠ核酸内切酶，DL2000，λ-EcoT14ⅠdigestDNA相对分子质量标准（TakaraBiotec公司），PCR产物纯化试剂盒（Macher

7、ey-Nagel公司），质粒提取试剂盒（Axygen公司），大肠杆菌DH5α，Lewis细胞株以及载体pIRES2-eGFP为本室保存。　　1.2引物的设计与合成　　根据基因库中小鼠GITRL基因ORF序列，通过PrimerPremier5.0软件设计引物，由上海博亚生物技术有限公司合成。引物序列：上游引物：5′-GAGAATTCATGGAGGAAATGCCTTGAG-3′,下游引物：5′-CCCGTCGACCTAAGAGATGAATGGTAGATC-3′，引物中增加了EcoRⅠ（GAATTC）及Sal