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《1α真核表达质粒的构建及其在mcf-7细胞中的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、1α真核表达质粒的构建及其在MCF-7细胞中的表达2006年8月第26卷第8期基础医学与临床Basic&ClinicalMedicineAugust2006V01.26No.8文章编号:1O01-6325(2006)08-0888-06研究论文pcDNA3一HIF一1O/.真核表达质粒的构建及其在MCF一7细胞中的表达苏燕,李宏伟,张静,修瑞娟(中国医学科学院中国协和医科大学微循环研究所,北京100005)摘要:目的构建低氧诱导因子let(HIF.1et)真核表达质粒,并在MCF-7细胞中进行功能验证.方法
2、利用RT.PCR扩增带有XbaI和HindIll酶切位点的HIF-let编码基因,插入T载体测序正确后,克隆人pcDNA3真核表达载体,然后将其转染MCF-7细胞.Westernblot和双荧光素酶报告基因法分别检测HIF-1et表达及其DNA结合活性;实时定量PCR检测HIF-let对低氧诱导基因C—METmRNA表达的影响;Caspase3/7活性检测来初步判断HIF-1et对低氧MCF-7细胞凋亡的影响.结果酶切及测序结果证明~DNA3一HIF.1et表达质粒的DNA序列完全正确.将此质粒转染MCF-7细胞后
3、,HIF-1et蛋白表达明显增加,它不仅增强了pGL3-EPO-HRE报告基因活性而且促进rC—METmRNA的表达,同时还降低了低氧MCF-7细胞中Caspase3/7的水平.结论pcDNA3-HIF-let真核表达质粒构建成功,它不但具有很强的DNA结合和诱导活性,而且在细胞低氧过程中具有一定的抗凋亡作用.关键词:低氧;低氧诱导因子.1ot;质粒构建;基因表达;凋亡中图分类号:R363文献标识码:AConstructionofpcDNA3—-HIF—-loteukaryoticexpressionvectora
4、nditsexpressioninMCF一7cellsSUYan,LIHong—wei,ZHANGJing,XIURui-juan(InstituteofMierocirculation,PekingUnionMedicalCollege&ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100005,China)Abstract:ObjectiveToconstructpcDNA3一HIF一1仅eukaryoticexpressionvectorandtoinvestigate
5、itsfunctioninbreastcancerMCF-7cells.MethodsRT—PCRwasappliedtoamplifyhumanHIF一1仅cDNAfromMCF-7cellswithapairofsequencespecificprime~carryingarestrictionenzymesiteXbaIorHind11Ioneach5end.HIF一1仅cDNAwasinsertedintopMD18一Taftersequencing,andtheninsertedintopcDNA3vec
6、tor.TherecombinantvectorwastransfectedintoMCF-7cellstoobserveitsexpressionandfunctionbyWesternblotanddual—luciferasereportergeneassay.Realtime—PCRwasperformedtodetecttheinducibleexpressionofC—METmRNAbyHIF一1仅.theanti—apoptoticeffectofHIF一1underhypoxiawasanalyse
7、dbydetectingtheCaspase3/7activity.ResultsThesequenceofpcDNA3一HIF一1仅isidenticalwiththegenebank.ItenhancestheexpressionofHREreportergeneandC—METmRNA.butdecreasestheCaspase3/7activityinMCF-7cellsunderhypoxia.ConclusionThepcDNA3一HIF一1仅eukaryoticexpressionvectorwas
8、successfullyconstructed,itnotonlyhasstrongDNAbindingandinducingactivity,butalsohasanti—apoptoticeffectinhypoxiaMCF一7cells.Keywords:hypoxia;hypoxiainduciblefactor—let;plasmidconstru
