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1、大鼠IL-10基因真核表达质粒的构建及其在BRL细胞中的表达作者：陈运新,黄月红,陈治新,郑伟达,王小众【摘要】 目的:构建大鼠IL-10基因的真核表达载体,观察其在大鼠肝细胞系BRL中的表达,比较有无受体介导的脂质体的转染效率。方法:抽提外周血单个核细胞的总RNA,通过RT-巢式PCR方法获得大鼠IL-10的全长编码序列,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.0,并进行限制性内切酶酶切及测序鉴定。将重组质粒分别通过脂质体TransfastTM与去唾液酸糖蛋白受体介导的脂质体PEIjet-gal转入大鼠肝细胞系BRL,通过RT-PCR方法检测IL-10mRNA的表达,比较二者的转染效
2、率,用ELISA法检测后者分泌型IL-10的表达。结果:经酶切及测序鉴定证实,重组质粒插入片段与大鼠IL-10的全长编码序列完全相符。发现受体介导的脂质体PEIjet-gal转染效率明显高于非受体介导的脂质体TransfastTM。通过受体介导的脂质体转染,BRL细胞获得高水平的IL-10表达。结论:成功地构建pcDNA3.0-IL-10重组质粒。受体介导的脂质体对肝细胞有较高的转染活性,可能成为IL-10基因治疗肝纤维化的有效转染载体。【关键词】白细胞介素-10基因治疗去唾液酸糖蛋白受体肝细胞12 ［Abstract］AIM:Toconstructeukaryoticexpres
3、sionvectorofratIL-10geneandobserveitsexpressioninhepatocytecelllineBRL.METHODS:TotalRNAwasextractedfromratperipheralbloodmononuclearcells.ThefulllengthcodingregionofIL-10wasamplifiedbyRT-nestedPCRandclonedintoeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.0.TherecombinantplasmidwastransfectedintoBRLcellswith
4、eitherliposomeTransfastTMorasialoglycoproteinreceptormediatedliposomePEIjet-galrespectively.TheexpressionofIL-10mRNAwasdetectedwithPCRandthatofIL-10secretedfromBRLcellstransfectedbyliposomePEIjet-galwasdetectedwithELISA.RESULTS:Therecombinantplasmidwasidentifiedandconfirmedwithdigestionofrestri
5、ctionendonucleaseandDNAsequencing.ReceptormediatedliposomePEIjet-galexhibitedsignificantlyhighertransfectionefficiencythanliposomeTransfastTMandhigherlevelsecretoryIL-10expressedinBRLcells.CONCLUSION:TheeukaryoticexpressionvectorofIL-10genewassuccessfullyconstructed.Asialoglycoproteinreceptor-m
6、ediatedliposomehadhightransfectionefficiencyonhepatocytes,suggestingthatitcouldbeapotentialhepatocyte-targetingdeliverysystemforIL-10genetherepy.12 ［Keywords］interleukin-10;genetherapy;asialoglycoproteinreceptor;hepatocyte 肝纤维化是多种慢性肝病发展为肝硬化的共同病理过程。白细胞介素-10（IL-10）是一种具多效性的细胞因子,在肝纤维化的进程中扮演重要的负反馈
7、角色［1］。引入外源性IL-10也被证实对肝纤维化有拮抗作用［2］。但是由于重组IL-10半衰期很短,难以在体内维持一个相对稳定的浓度;静脉用药,其作用缺乏肝脏靶向性。而探讨通过合适途径进行IL-10的基因治疗,则有可能解决上述问题,具有一定的应用前景。本实验中构建大鼠IL-10基因的真核表达载体,并通过受体介导的脂质体和非受体介导的脂质体转染大鼠肝细胞系BRL,观察IL-10的表达情况,比较2种有无受体介导的脂质体的转染效率,为下一步IL-10基因治疗肝
