人snca基因真核表达载体的构建及其在pc12细胞中的表达

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1、人SNCA基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达：钱进军,程言博,刘春风,杨亚萍,刘康永【摘要】　　目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFPC3SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tαsynuclein(SNCA)的单克隆PC12细胞株。方法:通过RTPCR方法扩增SNCA基因,TA克隆后测序。在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoRI、BamHI两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C（Ala30Pro）、G209A（A

2、la53Thr）的重组真核表达载体pEGFPC3SNCA,并以PCR、双酶切、测序鉴定。以重组质粒pEGFPC3SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞;以G418进行筛选;以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tαsynuclein的单克隆PC12细胞株,并以稳定转染pEGFPC3的PC12细胞作为对照组细胞,通过RTPCR、:ToconstructrebinanteukaryoticexpressionvectorspEGFPC3SNCAcontaininghumanutationsA30P,A53T

3、αsynuclein(SNCA),andtoobtainmonoclonalPC12celllinesoverexpressinghumanutationsA30P,A53Tαsynucleinbystabletransfection.METHODS:HumanousmutationoritsG88C(Ala30Pro)andG209A(Ala53Thr)pathogenicmutationutagensisusingprimervarianceinmononucleotide.AnddifferentrebinantplasmidspEGFPC3

4、SNCAedigestionandDNAsequencing.PC12cellsidspEGFPC3SNCAbyliposometransfectionmethod,screenediteddilutionmethodtoobtaindifferentmonoclonalPC12celllinesstablyoverexpressinghumanonoclonalPC12celllinesicroscopy.RESULTS:AccordingtoresultofPCR,thedoubledigestionandgenesequencing,itedt

5、hatrebinanteukaryoticexpressionvectorscontainingousmutationoritsAla30ProandAla53Thrpathogenicmutationhadbeenconstructedsuccessfully.BymeansofRTPCR,I1640购自Invitrogen公司;PC12细胞株购自中国科学院上海细胞所;小牛血清购自杭州四季青公司;Taq酶购自TaKaRa公司;总RNA提取试剂为Gibco的TRIzol试剂;反转录PCR试剂盒购自Fermanas公司;Lipofectamine2000转

6、染试剂盒购自GbicoBRL公司;G418购自Mediatech公司;胰蛋白酶、兔抗人αsynucleinmAb购自Sigma公司;HRP标记的羊抗兔IgG的二抗购自DAKO公司;ECL显色剂购自Amersham公司。　　1.2方法　　1.2.1PCR引物的合成根据GenBank中相应cDNA基因序列,自行设计引物,委托上海英骏生物有限公司合成,引物序列:P1:5′GTGTGGTGTAAAGGAATTCATT3′;P2:5′CGCGGATCCAGAAACTGGGAGCAAAGATA3′。　　1.2.2总RNA的提取及RTPCR扩增在50μL反应

7、体系中加入10×buffer5μL,10mmol/L,dNTP1μL,引物1、2各1μL,5U/μLTaq酶0.5μL,模板cDNA2μL,ddH2O40μL,计反应体系50μL。PCR反应条件为94℃5min,94℃30s,55℃30s,72℃45s,后3步反复进行30个循环。扩增产物用Uuiq10柱式DNA胶回收试剂盒提纯。　　1.2.3野生型SNCA基因的TA克隆取胶回收产物7.5μL加入1μLTvector、1μL10×ligationbuffer、0.5μLT4DNAligase,混合为10μL连接反应体系于4℃过夜。将10μL连接液与200

8、μL感受态细菌混匀,冰浴30min后于42℃水浴90s,置冰浴2m