人类基因xapc7真核表达载体的构建及其在smmc7721细胞中的表达

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1、人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC7721细胞中的表达作者：黄湘,潘华政,王穗海,赵玉梅,李明【摘要】　　目的:构建pcDNA3.1()/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC7721中的表达。方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7cDNA全长序列,将之与pMD18T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1()中。构建好的pcDNA3.1()/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选

2、,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RTPCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平。结果:pcDNA3.1()/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RTPCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础。【关键词】真核表达质粒SMMC7721XAPC7构建表达　　XAPC7基因编码人类

3、蛋白酶体α7亚基（proteasomesubunit,10alphatype7）,该蛋白是20S蛋白酶体核心复合体的一个α亚基。作为蛋白酶体的一个亚基,XAPC7编码产物参与了HBV、HCV和HIV病毒的复制及多种蛋白质的降解,并与HBx、HIF1、cAbl及Arg等多种肿瘤相关的重要蛋白质相互作用;同时该蛋白还参与膜蛋白的转运及对蛋白酶体活性的调节等;此外本基因定位于20q13.33染色体,既往研究提示人类肿瘤普遍伴随20q的扩增[1,2],但XAPC7在肿瘤方面的研究目前国内外鲜有报道。为了研究XAPC7编码蛋白在肿瘤发生发展中的作用,我

4、们构建了重组人XAPC7真核表达质粒,并将其转染入人肝癌细胞系SMMC7721中,以便进一步探讨其对肝癌细胞生长、死亡以及浸润、转移的影响。　　1材料和方法　　1.1材料大肠杆菌DH5α和人肝癌细胞系SMMC7721均由本实验室保存。原核重组表达质粒pET28b/XAPC7由上海复旦大学季朝能教授提供。质粒小量抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自优晶公司。限制性核酸内切酶BamHI、XhoI、T4DNA连接酶、DNAMr标准(DL2000)、pMD18T载体均购自大连宝生物工程有限公司。阳离子脂质体Lipofectamine2000、TRIzo

5、l试剂、G418和pcDNA3.1()真核表达载体购自Invitrogen公司。新生牛血清(FBS)购自GibcoBRL公司。　　1.2方法10　　1.2.1引物设计为人XAPC7基因克隆及半定量鉴定之用,根据GenBank的基因序列(NM_002792),应用软件PrimerDesigner5.0各设计一对克隆引物及半定量引物。克隆引物:上游:5′CTCGAGATGAGCTACGACCGC3′;下游:5′GGATCCTGATGCTTTCTTTTGTTTC3′,在上、下游引物中分别引入XhoI、BamHI酶切位点,扩增大小为747bp的

6、人XAPC7cDNA全长序列;半定量引物:上游:5′GCCATCACCGTCTTCTCG3′;下游5′GCCCATTGCTCTGCGTAT3′,扩增片段长度为355bp。内参照βactin的引物序列为:上游:5′TGTGACGTGGACATCCGCAAAG3′;下游:5′TGGAAGGTGGACAGCGAGGC3′,扩增片段为206bp。所有引物均由Invitrogen公司合成。　　1.2.2目的基因cDNA的获取以pET28b/XAPC7原核重组表达质粒为模板进行PCR扩增,反应体系,质粒模板0.1μL,10×ExTaqPCR

7、Buffer5μL,dNTP(2.5mmol/L)4μL,灭菌蒸馏水38.65μL,TaKaRaExTaq(5U/μL)0.25μL,上游引物(20μmol/L)1μL,下游引物(20μmol/L)1μL;反应条件:94℃4min;94℃30s,60℃30s,72℃40s扩增25个循环;72℃延伸7min。PCR产物电泳后,切胶回收目的片段。　　1.2.3T载体克隆用凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物,10并用pMD18T载体连接试剂盒将目的片段与pMD18T载体连接。连接反应体系为:SolutionI5μL,pMD18TDNA1μL(约50

8、ng),PCR产物1μL(约50ng),dH2O3μL,置于16℃连接2h后,用大肠杆菌DH5α感受态进行转化。随机挑取几个单菌落,用X