人hmgb1真核表达载体的构建及其在u937细胞中的表达

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1、山东省医学科学院硕士学位论文人HMGB1真核表达载体的构建及其在U937细胞中的表达姓名：徐洁申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：赵跃然20100301人HMGBl真核表达载体的构建及其住U937细胞中的表达人HMGBl真核表达载体的构建及其在U937细胞中的表达专业免疫学研究生徐洁导师赵跃然教授中文摘要Highmobilitygroupbox-l(高迁移率族蛋白1，HMGBI)是HMG家族成员之一，存在于一切真核细胞当中，是细胞核内非组蛋白成分的染色体结合蛋白，序列保守，含量丰富。他们具有稳定核小体；参与DNA转录、复制和DNA修复等功能。近年来的研究显示，HMGBl除在细胞核

2、内与染色体结合行使功能外，还能作为致炎因子在细胞外发挥作用，促进炎症反应，介导内毒素血症的发生。在急、慢性炎症反应中，细胞内和细胞外都可检出HMGBI。HMGBl可以在细胞坏死过程中被动释放到细胞外，还可以由激活的免疫细胞(单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞)主动分泌到细胞外。有研究显示，在系统性红斑狼疮、类JxL湿性关节炎、干燥综合征等自身免疫性疾病病灶的活组织检查中都有HMGBl的过表达，并且兔和小鼠关节炎动物模型在应用了抗HMGBl的治疗之后症状缓解。证明HMGBl在自身免疫性疾病的致病中作用重大。很多研究发现，HMGBl参与了肿瘤的转移，而且与前列腺癌，胰腺癌等很多肿瘤的不良预后

3、相关。HMGBI与肿瘤的发展和蔓延关系重大，因此以HMGBl作为恶性肿瘤的治疗靶点还有待于更深层次的研究。1目的构建HMGBl真核表达载体，经阳离子脂质体转染进入U937细胞当中进行表达，为今后研究HMGBI的作用机制，HMGBI与单核细胞之l’日j的相互作用，探讨HMGBl在自身免疫性疾病和肿瘤转移中的作用奠定基础。2方法2．1重组人HMGBl基因真核表达载体的构建2．1．1限制性核酸内切酶消化pMD／HMGBl分离HMGBI基因2．1．2构建重组载体pCITE—EGFP／HMGBl2．1．3菌落PCR鉴定重组载体2．1．4酶谱分析鉴定重组载体山东省医学科学院顾Ij学位论义2．2重

4、组真核表达载体pCITE．EGFP／HMGBl转染U937细胞及转染后的表达2．2．1阳离子脂质体介导转染U937细胞2．2．2倒置荧光显微镜检测阳性转染细胞2．2．3Westernblot检测HMGBl蛋白表达3结果3．1重组真核表达载体pCITE．EGFP／HMGBl的构建3．1．1用限制性核酸内切酶EcoR]NSatI消化克隆载体pMD／HMGBl得到大小为约648bp的HMGBI目的基因片段3．1．2用相同的限制性核酸内切酶酶切制备丌环线性载体pCITE．EGFP并用T4DNA连接酶与分离产物人HMGBl基因片段相连接，转化感受态大肠杆菌DH5a菌株，固体LB细菌培养板上有大

5、量菌落长出3．1．3以单克隆菌落裂解液为模板，克隆载体pMD／HMGBl为阳性对照，进行菌落PCR扩增，PCR扩增产物电泳结果与阳性对照一致，表明目的基因片段已经插入pCITE．EGFP中3．1．4重组质粒经B口聊HI酶切后，得至1J4983bp平1]1062bp大小的片段；经胁耐III酶切后，得到5050bp和995bp大小的片段，均与预期结果相符，也表明目的基因片段已经插,K．pCITE．EGFP中3．2重组真核表达载体pCITE．EGFP／HMGBl转染U937细胞及转染后的表达3．1．1倒置荧光显微镜检测结果显示，经过G418筛选的细胞均为表达EGFP的阳性转染细胞3．1．2

6、Westernblot检测结果显示，转染pCITE．EGFP／HMGBl后的U937细胞HMGBl表达量增多4结论4．1成功构建重组人HMGBl真核表达载体pCITE．EGFP／HMGBl4．2以其转染U937细胞后，外源性HMGBl基因在U937细胞中成功表达关键词：高迁移率族蛋白质类；真核细胞；单核细胞ConstructionofeukaryoticexpressionvectorofhumanHMGB1anditsexpressioninU937cellsMajorPostgraduateSupervisorImmunologyXuJieProfessorZhaoYue—Ran

7、ABSTRACTHighmobilitygroupbox．I(HMGBl)isamemberofthenonhistone，chromatin．associatedhigh．mobilitygroupfamilyofproteins．Itisahighlyconservedgeneexpressedbyalleukaryoticcellswithlargequantities．HMGB1playsanimportantroleinnucleosomearc