RhoCmiRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达

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1、RhoCmiRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林长春【摘要】目的体外合成RNA干涉小分子构建pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA真核表达载体，分析其在人卵巢癌细胞SKOV3中稳定表达情况。方法设计并合成单链oligo，经退火形成双链的DNAoligo，将其与线性的pcDNA6.2GW/EmGFPmiR质粒连接，构建重组质粒pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoC

2、miRNA真核表达载体，经扩增、筛选、鉴定及测序后，用脂质体法将重组质粒转染SKOV3细胞，筛选稳定转染细胞系、观察转染细胞的形态并进一步通过Western印迹法检测细胞内RhoC蛋白表达。结果重组质粒进行PCR鉴定及DNA序列测定证实DNAoligo已被成功连接到载体中并且序列完全正确；经重组质粒转染的SKOV3细胞24h后的荧光显微镜下观察到少量细胞带有绿色荧光信号，RhoCmiRNA稳定转染的SKOV3细胞形态变圆，折光性增强，收缩不铺展。Western印迹结果显示，与SKOV3细胞株及pc

3、DNATM6.2GW/EmGFPmiRneg细胞相比，pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA细胞中RhoC蛋白表达水平明显降低，表明所设计的RhoCmiRNA能有效抑制SKOV3细胞中内RhoC蛋白表达。结论该实验成功构建了RhoCmiRNA真核表达载体pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA，利用脂质体法将其转染卵巢癌细胞后，能有效地抑制细胞内RhoC蛋白表达，为进一步研究RhoC的功能及探讨以RhoC为靶点的基因治疗提供了研究平台。【关键词】卵

4、巢肿瘤；RhoC蛋白；小分子干扰RNA(RNAi)；真核表达载体　　ConstructionofRhoCmiRNAeukaryoticexpressionvectoranditsstableexpressioninovariancarcinomacell　　PANYing，MAOLiJun，SUNYanXia,etal.　　DepartmentofGynecologyandObstetrics，ChinaJapanUnionHospital，JilinUniversity，Changchun

5、130033，Jilin，China【Abstract】ObjectiveToconstructtheeukaryoticexpressionvectorpcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNAandanalyseitsexpressioninovariancarcinomacellSKOV3.MethodsSinglestrandoligowassynthesedandligatedwithlinearpcDNA6.2GW/EmGFPmiRtoconstructrecom

6、binantplasmidpcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA，afteramplification，screening，determinationandsequencing，itwastransfectedintoSKOV3cells.ScreeningwasconductedtoacquirethestabletransfectionstrainandtheexpressionofRhoCwasconfirmedbyWesternblot.ResultsDNAoligo

7、wassuccessfullyligatedwiththeexpressingvectorbyDNAsequencing.SKOV3cellswereobservedwithgreencolorafterthetransfectedrecombinantplasmidintothecellsfor24hunderfluorescencemicroscope.TheexpressionlevelofRhoCinSKOV3cellstransfectedwithpcDNATM6.2GW/EmGFPR

8、hoCmiRNAwassignificantlydecreasedcomparedwiththatofSKOV3cellsandthosetransfectedwithpcDNATM6.2GW/EmGFPmiRneg.ConclusionsTheeukaryoticexpressionvectorpcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNAissuccessfullyconstructedanditcaninhibittheexpression