β防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞hepa16中的稳定表达

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1、β防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞Hepa16中的稳定表达作者：梅寒芳金小宝朱家勇【摘要】　　目的克隆抗菌肽β防御素2（mBD2）基因,构建真核分泌性表达载体,使其在Hepa16细胞中稳定表达。方法Trizol试剂提取C57BL/6鼠肾总RNA,RTPCR扩增mBD2成熟肽基因,OverlapPCR在成熟肽基因上游加上鼠IgК信号肽基因，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)，PCR、酶切和测序鉴定正确后，脂质体法转染Hepa16细胞,G418筛选,RTPCR和Wester

2、n印迹法从mRNA和蛋白角度鉴定mBD2分子的表达。结果成功克隆含有信号肽的IgКmBD2序列，并且构建pcDNA3.1(+)/IgКmBD2真核分泌性表达载体，实现了mBD2分子在Hepa16细胞中稳定表达，RTPCR从细胞总RNA中扩增得到202bp的IgКmBD2基因，Western印迹法鉴定细胞培养上清中有mBD2蛋白分子表达。结论成功构建了pcDNA3.1(+)/IgКmBD2真核分泌性表达载体,转染得到稳定表达mBD2的Hepa16细胞株,为进一步研究mBD2的生物学特性

3、及抗肝癌机制奠定细胞学基础。【关键词】防御素；天然免疫；肝癌；OverlapPCR【Abstract】ObjectiveToclonebetadefensin2(mBD2)genefromtotalRNAofmousekidney,andtoconstructmBD2secretary11eukaryoticexpressionvector,thenrealizeitsexpressioninHepa16cells.MethodsTotalRNAwasisolatedfromkidneyofC

4、57BL/6micebyTrizolreagent.DNAsequencecodingformaturemBD2wasamplifiedbyRTPCR.ToaddamurineIgκsignalpeptidesequencebyoverlapPCR.AftersuccessfullyTAclone,IgκmBD2wassubclonedintotheplasmidpcDNA3.1(+).ThepcDNA3.1(+)/IgκmBD2wasidentifiedbyPCR,endonuclea

5、sedigestion,andsequencing.TheHepa16cellsweretransfectedwithpcDNA3.1(+)/IgκmBD2byLiposome2000andselectedwith400mg/LG418for8w.IdentificationofsteadyexpressionofmBD2wasconfirmedbyRTPCRandWesternblot.ResultsTheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(+)/Igκ

6、mBD2wassuccessfullyconstructed.StableexpressionalcelllineofHepa16wasobtainedbytransfectingpcDNA3.1(+)/IgκmBD2intoHepa16byLiposome2000.ThesteadyexpressionofmBD2wasconfirmedbyRTPCRandWesternblot.ConclusionsTheeukaryoticvectorofpcDNA3.1(+)/IgκmBD2i

7、ssuccessfullyconstructed,andmBD2stableexpressionalHepa16celllineisidentified,whichisgoodfoundationforfurtherresearchonbiologicalcharacteristicandantitumormechanismsofmBD2.　　【Keywords】Defensin;Naturalimmunity;Liver11cancer;OverlapPCR　　肝癌的发病率和死亡率占肿瘤的

8、第二位〔1〕，由于起病隐匿，多数患者在发现时已失去手术机会，姑息治疗复发率高，5年生存率仅7%〔2〕。因此，如何为肝癌患者创造二期手术机会，防止复发和转移是肝癌治疗的首要问题。β防御素2（mBD2）是抗菌肽的一种，是天然免疫的重要组成部分。Biragyn等〔3〕研究表明mBD2可趋化未成熟树突状细胞，还可作为TLR4的内源性配体促进树突状细胞成熟，产生一系列促炎症因子、趋化因子，上调共刺激分子表达，是一种天然的免疫佐剂。本研究将构建mBD2分泌性真核表达载体，并实现mBD2分子在