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1、三种鸭防御素真核表达载体构建及其表达探析摘要：为研究鸭防御素的真核表达，人工合成了鸭防御素AvBD2.AvBDIO和AvBD12基因，并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒；重组表达质粒经酶切鉴定正确后，分别转染HEK293细胞进行表达，用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明，酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中；真核表达质粒转染HEK293细胞24h后，在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达；RT-PCR能检测到目的基因mRNA,但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带关键词：鸭防御素；
2、真核表达；HEK293细胞中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：0439-8114(2016)24-6597-04D0I：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.068由于抗生素易导致药物残留、病原耐药性等问题，人们希望研发出安全有效的抗菌肽类药物，替代部分抗生素的使用。禽类防御素(Avianbetadefensin,AvBD)作为一类重要的内源性抗菌肽，具有广谱的抗菌活性和免疫调节功能[1],在禽类先天性免疫和获得性免疫中均发挥着重要作用。因此，禽类防御素极具新药开发价值，有望用于畜禽疾病的防控目前，人们已在家禽及某些野禽中发现了数十种禽类
3、防御素，并且在大肠杆菌或酵母菌中成功表达了多种禽类防御素。然而，关于禽类防御素在动物细胞中表达的报道却很少。理论上，动物细胞能为表达蛋白提供更好地表达后加工和修饰，是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主［2］。如果能用动物细胞表达禽类防御素，将为禽类防御素的研究和应用提供帮助。本研究根据GenBank中已发布的鸭防御素基因序列，人工合成了3种鸭防御素AvBD2、AvBDIO和AvBD12基因，并构建其真核表达载体，在HEK293细胞中进行了表达研究,为鸭防御素在动物细胞中的表达提供了参考1材料与方法1.1细胞、菌株与质粒HEK293细胞及真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag
4、-N由长沙赢润生物技术有限公司提供；大肠杆菌DH5?琢感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；表达猪B防御素1（PBD1）的重组质粒pDoub1eEx-EGFP-f1ag-N-PBD1由武汉市农业科学技术研究院畜牧兽医科学研究所构建1.2主要试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNAMarker和蛋白质Marker等分子生物学试剂购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、RNA提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；质粒小提试剂盒购自OMEGA公司；flag标签抗体购美国CMC公司；HRP标记羊抗小鼠IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；转染试剂Lipof
5、ectamin2000购自Invitrogen公司；PCR用试令1-鹤阅暇卜滴彳奚❷物科技有限公司；牛血清和细胞培养基为Gibco公司产品；其他常规试剂为分析纯1.3方法1.3.1鸭防御素基因的人工合成根据GenBank上公布的序列信息，人工合成鸭防御素AvBD2（登录号AY641439.1）、AvBDIO（登录号XM_005028240.1）和AvBD12（登录号KR018387.1）基因片段，并在基因片段两端引入BamHI和EcoRI酶切位点。基因合成后连接大肠杆菌克隆载体pUC57-Simple,测序验证合成的序列是否正确1.3.2重组表达质粒的构建根据设计的酶切位点将合成的
6、基因片段进行双酶切，用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的基因片段。同法回收酶切后的真核表达质粒，按如下反应体系和条件进行连接反应：10XT4DNALigaseBuffer1.0PL,T4DNALigase1.0uL,回收的pDoub1eEx-EGFP-f1ag-N质粒0.7uL,回收的AvBD基因片段7•3yL,总反应体积10.0uL,16°C恒温水浴中连接过夜1.3.3重组表达质粒的提取与酶切鉴定取大肠杆菌DH5?琢感受态细胞100uL,加入连接产物5UL并混匀,置冰上10min后，42°C水浴热激90s,随即冰浴2min；加入500uLLB培养基，恒温摇床振荡培养30min使其复
7、苏；复苏后的菌液10000r/min离心2min,弃去500PL上清液，用剩余的100UL重悬菌体，涂布于含有25ug/mL卡那霉素的LB琼脂平板上；37°C倒置培养12〜16h,直至长出单菌落；挑取平板上长出的单菌落，接种到含卡那霉素的LB培养基中，恒温摇床振荡培养约8h。取培养后的菌液,用质粒小提试剂盒提取重组表达质粒，进行双酶切鉴定。酶切鉴定的反应体系：lOXKBuffer2.0uL,NheI1.0uL,EcoRI1.0uL,重组表达质粒12.0uL,加ddH2
