trbp及其截短体真核表达载体的构建与表达

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1、TRBP及其截短体真核表达载体的构建与表达作者：韩涛张勇孙书明,孟艳玲,李伟,郭张燕,杨安钢【摘要】目的:构建TRBP及其截短体真核表达载体,并检测其在HeLa细胞中的表达。方法:设计引物扩增TRBP全长及其截短体TAB、TAC、TBC基因序列,然后将各基因片段克隆入真核表达载体pFlagCMV4。用脂质体法转染HeLa细胞,经Westernblot方法检测目的基因在转染细胞中的表达。结果:经过酶切鉴定与测序证实,TRBP全长及其截短体TAB、TBC、TAC基因真核表达载体构建成功,经Westernblot可检测转染细胞中各基因的表达。结论:成功构建了TRBP全长基因及其截短体TAB、T

2、AC和TBC基因真核表达载体,在转染细胞中可以检测到目的基因的表达。【关键词】TRBP;RISC;miRNA;真核表达TRBP（TARRNAbindingproteins）首先作为HIV1反式激活应答(transactivationresponse,TAR)RNA结合蛋白被分离鉴定出来。TRBP全长366aa,属于dsRNA结合蛋白家族,具有3个dsRBD,位于dsRBD2内部的KR螺旋模序负责RNA结合,第3个结构域即C末端碱性结构域主要介导蛋白质间的相互作用［1］。TRBP具有多种生物学功能,包括调控精子生成与发育、抑制PKR激活、调节HIV91基因表达、参与RNAi（RNAi

3、nterferenc）过程等。TRBP是PKR的强抑制物,它通过直接结合和dsRNA扣押而发挥作用。TRBP不依赖PKR而依赖结构RNA,对翻译也有直接作用［2］。TRBP促进HIV1的表达和复制,在星形胶质细胞中PKR的高应答导致了HIV1的低复制和病毒结构蛋白的翻译低下,而TRBP抑制PKR激活,使病毒蛋白产生恢复,从而增强了HIV复制。研究表明TRBP通过对抗PKR介导的抗病毒免疫而在病毒翻译中具有关键作用［3］。TRBP、Ago2和Dicer都在miRNA加工和RNAi中发挥作用。TRBP在dsRNA和Dicer之间募集Ago2时起到桥梁作用,TRBP或Dicer缺失后成熟mi

4、RNA产生减少和siRNA功能的丧失,他们推断TRBP募集Ago2到RISC,将RNAi的启动和执行阶段相偶联［4］。TRBP与RNaseⅢ家族成员Dicer相互作用,并结合dsRNA,随后结合具有裂解dsDNA活性的Ago2蛋白,它们共同组成RISC复合体（RNAinducedsilencingcomplex）。dsRNA的一条链被递呈给Ago2蛋白从而导致siRNA和miRAN的产生［5］。在人细胞中TRBP是Dicer结合蛋白,它为siRNA及miRNA功能的发挥所必需。为了进一步探讨TRBP与Ago2间的相互作用和miRNA的生成机制,我们构建了TRBP全长及其截短体TAB、TA

5、C和TBC基因真核表达载体,并在转染细胞中检测到了目的基因的表达,为进一步研究其功能机制奠定了基础。91材料和方法1.1材料E.coliDH5α菌种、细胞系为第四军医大学免疫学教研室保存和培养。载体pFlagCMV4由本室保存,TaqDNA聚合酶、DNA限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司、新生牛血清购自杭州四季青生物公司。RPMI1640及脂质体LipofectAMINETM2000购自Invitrogen公司。小鼠抗Flag单克隆抗体(mAb)购自Sigma公司。HRP标记山羊抗小鼠二抗购自中杉公司。1.2方法1.2.1引物设计根据TRBP的基因序列设计引物为X1(

6、5′TTTGGTACCCACCATGAGTGAAGAGGAGCAAGGCTCCGGCACTACCACGGGCTGC3′),X2（5′TTTTCTAGAGTCGACTCACTTGCTGCCTGCCATGATCTT3′）,X6(5′TTTGGTACCGGGAGCATGCTGGAGCCG3′),X5(5′TTTTCTAGAATCCCGGGCATCCAGAGG3′),X8(5′GCCCTCAAACACCTCAAAGGGGTGCCTCTGGATGCCCGGGAT3′)和X9(5′ATCCCGGGCATCCAGAGGCACCCCTTTGAGGTGTTTGAGGGC3′)。1.2

7、.2RTPCR收集处于对数期生长的细胞,9使用TRIzol试剂提取总RNA,使用SuperScriptTMFirstStrandSystemforRTPCR试剂盒进行反转录,操作均按说明书进行。获取基因组cDNA。1.2.3pCMVTRBP、pCMVTAB、pCMVTBC、pCMVTAC真核表达载体的构建以cDNA为模板,用X1和X2进行PCR,扩增出TRBP全长基因,分别用X1和X5,X6和X2,扩增出T