mbmp┐4真核表达载体的构建及表达

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1、mBMP┐4真核表达载体的构建及表达　　0引言　　骨形态发生蛋白-4（BMP-4）具有诱导成骨潜能细胞向软骨细胞和成骨细胞方向分化并形成新骨的能力.随着基因转染技术的应用，将外源基因转入靶细胞内，通过靶细胞表达外源基因而发挥作用成为可能.本研究的目的是通过基因克隆和DNA重组技术构建可在真核细胞内表达的BMP-4表达载体，并观测外源基因在细胞内表达的情况，为探索将基因转移技术应用于骨折及骨不连等疾病的治疗奠定一定的实验基础.　　1材料和方法　　1.1试剂　　质粒pcDNA3和pSPT-18-mBMP-4均由吕振华博士馈赠，EcoRI和HindIII，T4DNA连

2、接酶、溴化乙锭（EB）、RNAase购自华美公司，普通琼脂糖、脂质体（lipofec-tamin）、G418、DMEM购自Gibco公司，胎牛血清购自Hy-clone公司.　　1.2仪器　　CO2孵箱，CO2培养箱，低温冷冻高速离心机，空气恒温摇床，水平电泳仪，TanonGIS凝胶图像处理系统等.　　1.3真核表达载体pcDNA3-mBMP-4的构建和鉴定　　氯化钙法将pSPT-18-mBMP-4质粒转化大肠杆菌感受态细胞HB101，氨苄青霉素筛选后挑选阳性菌落扩增，小量提取mBMP-4质粒并用EcoRI和HindIII消化，12g・L-1琼脂糖电

3、泳，鉴定后回收1.3kbmBMP-4片段;采用相同的酶消化pcDNA3质粒并回收5.3kb线状质粒片段;采用T4DNA连接酶定向克隆mBMP-4到真核表达载体pcDNA3中;将构建好的载体转化到大肠杆菌HB101中并大量扩增、回收、纯化;EcoRI和HindIII消化新构建的质粒，12g・L－1琼脂糖凝胶电泳鉴定，使用λDNA/HindIIImarker，溴化乙锭显色.　　1.4真核表达载体pcDNA3-mBMP-4转染NIH3T3细胞及其表达的检测　　采用脂质体（lipofectamine）转染法将真核表达载体pcDNA3-mBMP-4转入NIH

4、3T3细胞内（本实验室冻存），G418（350μg・mL-1）筛选转染阳性细胞;同样的方法转染pcDNA3质粒到NIH3T3细胞作为空白对照.打点杂交检测mBMP-4在mRNA水平中的表达.　　2.2mBMP-4在NIH3T3细胞内的表达　　转染真核表达载体的NIH3T3细胞在G418筛选的早期表现为大量细胞死亡，仅少量阳性细胞生存.阳性细胞经持续G418筛选和克隆化生长，转染后20d在培养瓶内生长到指数生长期的末期;以后阳性细胞均在G418筛选下培养，传代培养7d后传代，以后每代均为5～7d传代一次.打点杂交显示转染真核表达载体的实验组细胞均为阳

5、性，而转染空白载体的对照组细胞为阴性.　　3讨论　　基因转染技术是将外源基因转入细胞内并使之在细胞内表达的技术.早期主要是用来纠正某些遗传性缺陷性疾病，通过将相关基因转入缺陷动物体内并进行表达来达到治疗目的［1］.随着基因转染技术的发展，它已经不仅用于弥补基因的缺陷，也可用来治疗一些常规性疾病，如在类风湿性关节炎治疗中的探索性应用［2］.BMP在治疗骨折和促进骨不连中具有独特作用，其家族各成员基因序列已经明确，因此，构建它们的真核表达载体并转入患者体细胞内，通过在局部表达BMP并作用于成骨潜能细胞促进骨折愈合成为可能，这将使骨折的治疗变的更为简单.　　基因治疗的

6、关键步骤之一是真核表达载体的构建和能否在细胞内表达.本实验中所使用的mBMP-4基因和质粒pcDNA3中均含有EcoRI和HindIII酶切位点，因此通过定向克隆的方法将mBMP-4和质粒pcDNA3连接，亚克隆成为真核表达载体pcDNA3-mBMP-4，通过将其转染NIH3T3细胞证明其可在真核细胞内成功表达，说明该载体构建成功.pcDNA3-mBMP-4真核表达载体的成功构建，将为在分子水平研究BMP-4在骨折治疗中的作用机制和BMP与其他因子间的相互作用原理奠定一定实验基础，并为将来骨与关节的损伤的治疗和骨与软骨的组织工程的研究打下良好的基础.