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1、DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达【关键词】,盘状结构域受体2；Fc；DS区域；融合表达 【Abstract】AIM:ToconstructtheeukaryoticexpressionvectorofDDR2FcfusiongeneandtoinvestigateitsexpressioninHEK293cells.METHODS:ThetplifiedbyPCRrespectivelyfromtheratbraintissueandtheplasmidcontainingthefulll
2、engthcDNAofhumanIgG1Fc,andclonedtotheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(-)bydirectionalcloning.TheresultantrebinantplamidpcDNA3.1(-)/DDR2Fcetransfectionreagent.ThenRTPCR,MPs)的表达水平上调［1-2］.DDR2在类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)患者滑膜中呈过表达状态［3］,这些过度表达和活化的DDR2调节下
3、游信号通路产生大量MMPs,从而降解关节软骨中的主要成分Ⅱ型胶原，最终进一步破坏软骨和骨［4］.因此，研究和制备Ⅱ型胶原DDR2MMPs这一信号通路的竞争性阻断剂有重要意义.我们将DDR2中负责与Ⅱ型胶原结合的区域DSdomain［5］与IgG1Fc段融合起来在293细胞中进行表达,使其具备有活性的二聚化状态，为进一步研究其竞争性阻断剂功能奠定基础. 1材料和方法 1.1材料雄性SD大鼠（第四军医大学实验动物中心）；293细胞、pcDNA3.1(-)真核表达载体、大肠杆菌XL10菌株(本室保存)；Li
4、pofectamine2000(Invitrogen公司)；DMEM培养基(Gibco公司)；抗Fc抗体(第四军医大学免疫教研室惠赠)；D18T载体,T4DNA连接酶（TaKaRa公司）；质粒提取和DNA回收试剂盒（安徽优晶公司）. 1.2方法 1.2.1引物设计DDR2的DSdomain片段（命名为DS）的上游引物序列：5′TCTAGAGTCGACCTGAAATGATCCTGATTCCCAGAATG3′,其中TCTAGA序列为XbaⅠ酶切位点；DS的下游引物序列：5′GGTACCTCCACAACCA
5、TAAAGCTCGACCCTCATG3′,其中GGTACC序列为KpnⅠ酶切位点，TCC为额外引入的序列，将翻译成2个片段之间的柔性氨基酸Gly.Fc段的上游引物序列：5′GAATTCGGTACCGGAGGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC3′,其中GAATTC序列为EcoRⅠ酶切位点，GGTACC序列为KpnⅠ酶切位点，GGAGGC为引入的序列，将翻译成两个片段之间的柔性氨基酸GlyGly；Fc段的下游引物序列：5′AAGCTTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG3′,其中AA
6、GCTT序列为HindⅢ酶切位点，TCA为终止码的反向互补序列. 1.2.2模板制备及RNA反转录取大鼠脑组织0.1g，用Trizol法提取总RNA.取总RNA1μg加入oligo（dT）152μL，70℃温育10min，再加入5×RTbuffer5μL，dNTP（10mmol/L）2.5μL，AMV1μL，补DEPC水至25μL，于42℃下反应1h后95℃5min终止反应. 1.2.3PCR扩增及产物修饰在200μL反应体系中加入10×buffer20μL，dNTP（10mmol/L）4μL、上下游
7、引物（10μmol/L）各4μL、模板DNA(脑组织cDNA,Fc质粒)各8μL,pfu4μL,Taq1.2μL，补水至200μL.PCR扩增条件为94℃5min，94℃1min，52℃1min，68℃2min，后3步进行35个循环,最后，68℃延伸10min.扩增产物回收后溶于30μLTrisHCl（pH8.0）中，并进行加“A”反应. 1.2.4PCR产物克隆及序列测定上述加“A”后的PCR产物回收后直接与pMD18T载体连接，转化大肠杆菌XL10后，挑选克隆进行EcoRⅠ/HindⅢ酶切,鉴定片段
8、是否插入pMD18T载体中.将阳性克隆送公司测序，将测序结果与GenBank中的基因序列进行比对. 1.2.5融合表达载体的建立和鉴定EcoRⅠ/HindⅢ酶切FcpMD18T,将Fc片段切下,插入pcDNA3.1(-)中,并用EcoRⅠ/HindⅢ进行酶切鉴定.再用XbaⅠ/KpnⅠ将DSpMD18T中的DS切下,连入同样酶切过的FcpcDNA3.1(-),构建成DS/FcpcDNA3.1(-),用XbaⅠ/KpnⅠ,Kp
