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1、DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达【关键词】,盘状结构域受体2;Fc;DS区域;融合表达 【Abstract】AIM:ToconstructtheeukaryoticexpressionvectorofDDR2FcfusiongeneandtoinvestigateitsexpressioninHEK293cells.METHODS:ThetplifiedbyPCRrespectivelyfromtheratbraintissueandtheplasmidcontainingthefulll
2、engthcDNAofhumanIgG1Fc,andclonedtotheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(-)bydirectionalcloning.TheresultantrebinantplamidpcDNA3.1(-)/DDR2Fcetransfectionreagent.ThenRTPCR,MPs)的表达水平上调[1-2].DDR2在类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)患者滑膜中呈过表达状态[3],这些过度表达和活化的DDR2调节下
3、游信号通路产生大量MMPs,从而降解关节软骨中的主要成分Ⅱ型胶原,最终进一步破坏软骨和骨[4].因此,研究和制备Ⅱ型胶原DDR2MMPs这一信号通路的竞争性阻断剂有重要意义.我们将DDR2中负责与Ⅱ型胶原结合的区域DSdomain[5]与IgG1Fc段融合起来在293细胞中进行表达,使其具备有活性的二聚化状态,为进一步研究其竞争性阻断剂功能奠定基础. 1材料和方法 1.1材料雄性SD大鼠(第四军医大学实验动物中心);293细胞、pcDNA3.1(-)真核表达载体、大肠杆菌XL10菌株(本室保存);Li
4、pofectamine2000(Invitrogen公司);DMEM培养基(Gibco公司);抗Fc抗体(第四军医大学免疫教研室惠赠);D18T载体,T4DNA连接酶(TaKaRa公司);质粒提取和DNA回收试剂盒(安徽优晶公司). 1.2方法 1.2.1引物设计DDR2的DSdomain片段(命名为DS)的上游引物序列:5′TCTAGAGTCGACCTGAAATGATCCTGATTCCCAGAATG3′,其中TCTAGA序列为XbaⅠ酶切位点;DS的下游引物序列:5′GGTACCTCCACAACCA
5、TAAAGCTCGACCCTCATG3′,其中GGTACC序列为KpnⅠ酶切位点,TCC为额外引入的序列,将翻译成2个片段之间的柔性氨基酸Gly.Fc段的上游引物序列:5′GAATTCGGTACCGGAGGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC3′,其中GAATTC序列为EcoRⅠ酶切位点,GGTACC序列为KpnⅠ酶切位点,GGAGGC为引入的序列,将翻译成两个片段之间的柔性氨基酸GlyGly;Fc段的下游引物序列:5′AAGCTTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG3′,其中AA
6、GCTT序列为HindⅢ酶切位点,TCA为终止码的反向互补序列. 1.2.2模板制备及RNA反转录取大鼠脑组织0.1g,用Trizol法提取总RNA.取总RNA1μg加入oligo(dT)152μL,70℃温育10min,再加入5×RTbuffer5μL,dNTP(10mmol/L)2.5μL,AMV1μL,补DEPC水至25μL,于42℃下反应1h后95℃5min终止反应. 1.2.3PCR扩增及产物修饰在200μL反应体系中加入10×buffer20μL,dNTP(10mmol/L)4μL、上下游
7、引物(10μmol/L)各4μL、模板DNA(脑组织cDNA,Fc质粒)各8μL,pfu4μL,Taq1.2μL,补水至200μL.PCR扩增条件为94℃5min,94℃1min,52℃1min,68℃2min,后3步进行35个循环,最后,68℃延伸10min.扩增产物回收后溶于30μLTrisHCl(pH8.0)中,并进行加“A”反应. 1.2.4PCR产物克隆及序列测定上述加“A”后的PCR产物回收后直接与pMD18T载体连接,转化大肠杆菌XL10后,挑选克隆进行EcoRⅠ/HindⅢ酶切,鉴定片段
8、是否插入pMD18T载体中.将阳性克隆送公司测序,将测序结果与GenBank中的基因序列进行比对. 1.2.5融合表达载体的建立和鉴定EcoRⅠ/HindⅢ酶切FcpMD18T,将Fc片段切下,插入pcDNA3.1(-)中,并用EcoRⅠ/HindⅢ进行酶切鉴定.再用XbaⅠ/KpnⅠ将DSpMD18T中的DS切下,连入同样酶切过的FcpcDNA3.1(-),构建成DS/FcpcDNA3.1(-),用XbaⅠ/KpnⅠ,Kp