野生型mlk3真核表达载体的构建及其表达

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1、野生型MLK3真核表达载体的构建及其表达作者：金磊，岳军，杜彩萍，侯筱宇【摘要】目的构建野生型MLK3真核表达质粒并转染至COS-7细胞中表达。方法以大鼠海马总RNA为模板,通过RT-PCR分段扩增MLK3的序列，采用酶切、链接的方法先将目的基因克隆至pGEM-T，筛选正确的质粒后，再亚克隆至pcDNA3.1(+)。以脂质体转染法将构建好的重组质粒转染至COS-7细胞，通过免疫印迹鉴定重组质粒的表达。结果限制性内切酶酶切和测序结果表明，扩增出的野生型MLK3的序列正确。免疫印迹显示，转染的重组质粒在相对分子质

2、量92×103处有相应条带出现。结论成功构建了MLK3的真核表达质粒，重组质粒在COS-7细胞中高效表达。【关键词】MLK3;克隆;真核表达Abstract:ObjectiveToconstructtherebinantofidandtoexpresstherebinantintransfectedCOS-7.MethodsAccordingtothecDNAsequenceofMLK3(GenBank,BC081952),thesequenceofentspaltotalRNAasthetemplate.T

3、henthesefragmentsidofpcDNA3.1(+).TherebinantofpcDNA3.1-MLK3ediationoflipofectaminereagents.ImmunoblotmethodinetheexpressionofMLK3protEins.ResultsThetargetgeneedbyrestrictionenzymedigestionandsequencing.TheimmunoblottinganalysisindicatedthattherebinantofMLK3

4、idsofMLK3idology3)结构域、激酶结构域(Guanaylatekinase，GK)、亮氨酸拉链(leucinezipper)、Cd4c2/Rac(CRIB)相互作用序列、富含脯氨酸结构域(praline-richregiondomain，PRD)组成[2]。大鼠体内MLK3基因全长2553bp，蛋白编码序列850个氨基酸。　　研究表明，MLK3选择性地在中枢神经系统表达，其活化与多种神经退行性疾病，如阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)、帕金森病(Parkinsondiseas

5、e)以及脑卒中[3]有关。细胞外多种刺激均可激活MLK3，活化的MLK3激活MAPK信号通路引起细胞凋亡[4]。本室前期研究结果表明：β淀粉样蛋白(Aβ)激活MLK3-MKK7-JNK3信号通路是阿尔茨海默病发病机制中重要因素之一，使用MLK3的抑制剂K252a抑制MLK3的活性对Aβ引起的细胞凋亡具有保护作用[5]。因此，本实验构建野生型MLK3的真核表达质粒，用于转染体外培养的细胞，为深入研究神经退行性疾病的发病机制奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1载体、菌株与细胞株pGEM-T载体、

6、真核表达载体pcDNA3.1(+)、大肠杆菌JM101、细胞株COS-7均为本室保存。　　1.1.2试剂RNAgentsTotalRNAIsolationSystem、AccessRT-PCRSystem、P)均购自Promega公司;限制性内切酶EcoRI、KpnI、NheI、和T4DNAligase购自Neine2000、LB培养基、LB琼脂均购自Invitrogen公司;1kbDNAladder标准相对分子质量DNA购自TAKARA及Nea公司;兔源actin多克隆抗体购自Santacruz公司;引物由

7、上海生工生物工程技术服务有限公司合成;其他常用试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1引物设计与合成根据Genbank中的大鼠MLK3基因编码序列(BC081952)，分3段分别设计上下游引物P1/P2、P3/P4、P5/P6，其中在总上游引物(P1)的5′端引入NheⅠ酶切位点，在总下游引物(P6)5′端引入EcoRⅠ酶切位点(下划线)，引物P3、P4、P5中具有序列自身酶切位点KpnⅠ(斜体加粗)，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。　　P1：5′-GCTAGCATGGAGCCCTTGA

8、AGAACC-3′(总上游)　　P2：5′-CCACACCATAGGCTACCGCAAGACAGT-3′　　P3：5′-CTGGGGAGGTACCCTACCGT-3′　　P4：5′-GGTACCACGTGGCTTCATCC-3′　　P5：5′-GGTACCTAGATTCAGATGAC-3′　　P6：5′-GAATTCTCAGGGCCCTGCTTCTGGT-3′(总下游)　　1.2.2目的基因的扩增以