野生型p53-junb融合基因真核表达载体的构建

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1、野生型p53/junB融合基因真核表达载体的构建由于恶性肿瘤的发生、发展是一个多阶段、多基因参与的过程，同时不同的患者之间也具有较大的差异，因而导致单一的基因疗法往往效果不理想。最新的研究结果显示，肿瘤基因治疗最好的办法是寻找另一条涉及到多个基因的X络、可控制肿瘤的失控性生长和扩散的途径。野生型p53(pleVector购自TaKaRa；含junB基因mRNA序列全长cDNA基因的pOTB7质粒购自ProteintechGroup,Inc.(Chicago,USA)；人肝癌细胞株HepG2由本室冻存

2、。　　1.1.2主要试剂　　高保真热启动Taq酶、1kbDNALadderMarker、内切酶BglⅡ、SalⅠ及BamHⅠ、T4DNALigase购自TaKaRa；普通琼脂糖凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒购自Tiangen公司；Ampcilillin、Kanamycin购自Amresco；Lipofectamine2000脂质体转染试剂、细胞总RNA提取试剂(Trizol)购自Invitrogen公司；RevertAidFirstStrandcDNASynthesis试剂盒：Fermentas。　

3、　1.1.3主要仪器　　高速低温离心机581DR(EPPENDORF)，梯度PCR仪PTC-200(MJResearchInc,USA)，凝胶成像系统BIO-RAD(Italy)。　　1.1.4引物设计　　根据GenBank公布的p53(GeneID：7157)和junB(GeneID：3726)基因mRNA序列，分别长2640bp和1832bp，其中编码序列(CDS)分别长1182bp和1044bp，分别设计引物。p53：P1，5′-GAAGATCTGAGGAGCCGCAG-TCAGATCCTAG

4、-3′；P2，5′-GCGTCGACGTCTG-AGTCAGGCCCTTCTG-3′。　　JunB：P3，5′-GCGTCGACGGCTCCTCTACTTG-CACTAAAATGGAACAG-3′；P4，5′-CGGGATCC-TCAGAAGGCGTGTCCCTTGACCC-3′。结合载体情况，p53上游引物去除起始密码子并在5′端加上限制性内切酶BglⅡ，下游引物去除终止密码子并在5′端加限制性内切酶SalⅠ；junB上游引物去除起始密码子并在5′端加上限制性内切酶SalⅠ，下游引物不去除终止密码

5、子并在5′端加BamHⅠ，其中下划线部分为内切酶的酶切位点，前面的是保护碱基，粗斜部分为linker序列，即Gly-Ser-Ser-Thr柔性连接肽序列。以上设计的引物在理论上表达的蛋白经同源性比对后完全正确。　　1.2实验方法　　1.2.1p53及junB基因的PCR扩增　　以正常人外周血总RNA反转录得到的cDNA为模板，P1、P2为引物进行PCR扩增p53基因(94℃预变性5min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环，72℃延伸5min)；以pOTB7-junB质

6、粒为模板，P3、P4为引物进行PCR扩增junB基因(94℃预变性5min，94℃变性30s、67℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环，72℃延伸5min)。电泳及凝胶回收目的片段。　　1.2.2构建pDM19-T-p53和pDM19-T-junB　　p53基因及junB基因与T载体连接，转化感受态，挑选单克隆回收质粒，单、双酶切鉴定后送测序，将正确序列单克隆分别命名为pDM19-T-p53和pDM19-T-junB(图1)。　　1.2.3融合基因pEGFP-C1-p53/junB构建及鉴定　

7、　p53基因与pEGFP-C1载体连接：用BglⅡ及SalⅠ分别双酶切pMD19-T-p53及pEGFP-C1，回收约1.2kb的p53基因片段及4.7kb的pEGFP-C1片段进行连接，转化感受态，挑选单克隆，回收质粒并单酶切、双酶切及PCR鉴定，将其命名为pEGFP-C1-p53。pEGFP-C1-p53与junB基因连接：SalⅠ及BamHⅠ分别双酶切pDM19-T-junB及pEGFP-C1-p53，回收约1kb的junB基因片段及5.9kb的pEGFP-C1-p53片段进行连接，转化感受态

8、，挑选单克隆，回收质粒并单、双酶切鉴定。最后送测序，将测序结果完全正确的单克隆命名为pEGFP-C1-p53/junB(图1)。　　1.2.4融合基因pEGFP-C1-p53/junB转染人肝癌细胞株HepG2　　复苏冻存的HepG2细胞，用含80mL/L胎牛血清的1640培养液于37℃、50mL/LCO2孵箱中培养。真核表达载体pEGFP-C1-p53/junB用脂质体法转染人肝癌细胞系SMMC-7721(按照Lipofectamine2000脂质体转染试剂说明书操