β防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞hepa16中的稳定表达

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1、β防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞Hepa16中的稳定表达：梅寒芳金小宝朱家勇【摘要】　　目的克隆抗菌肽β防御素2（mBD2）基因,构建真核分泌性表达载体,使其在Hepa16细胞中稳定表达。方法Trizol试剂提取C57BL/6鼠肾总RNA,RTPCR扩增mBD2成熟肽基因,OverlapPCR在成熟肽基因上游加上鼠IgК信号肽基因，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)，PCR、酶切和测序鉴定正确后，脂质体法转染Hepa16细胞,G418筛选,RTPCR和ethodsTotalRNAkidneyofC57BL/6miceb

2、yTrizolreagent.DNAsequencecodingformaturemBD2plifiedbyRTPCR.ToaddamurineIgκsignalpeptidesequencebyoverlapPCR.AftersuccessfullyTAclone,IgκmBD2idpcDNA3.1(+).ThepcDNA3.1(+)/IgκmBD2BD2byLiposome2000andselectedg/LG418for8BD2edbyRTPCRandI1640细胞培养基(Gibco公司产品)、Trizol由Invitroge公司

3、提供，DL2000、MMLV、Taqenzyme、dNTP、T4DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、XbaⅠ等购自Takara公司，DL10000DNAMarker为MBI公司产品。质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自北京天根公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。羊抗鼠mBD2多克隆抗体购自SantaCruz公司，辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG抗体购自北京博奥森生物技术公司，DAB显色试剂盒为中杉金桥公司产品，真核转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。凝胶成像仪购自BioRad公司(USA)。　　1.2方

4、法　　1.2.1C57BL/6小鼠肾组织总RNA的提取及cDNA合成　　取6～8周龄C57BL/6鼠，颈脱臼处死，无菌条件下分离鼠肾组织，参照Invitrogen公司Trizol试剂说明书提取肾组织总RNA。取2.5μg总RNA进行反转录,总体积为50μl，反应条件为70℃10min，42℃60min,70℃15min。采用oligod(T)作为随机引物，获得cDNA，-20℃保存，PCR待用。　　1.2.2PCR扩增目的基因　　根据GenBank中查得的mBD2基因序列设计扩增mBD2成熟肽基因序列的引物，上游引物为:5′GAACTTGACCA

5、CTGCCACACC3′，下游引物为(框内部分为XbaⅠ酶切位点)：5′GCTCTAGATTATCATTTCATGTACTTGCAAC3′，扩增产物长度为131bp。反应条件为：94℃2min；94℃1min，53℃1min，72℃40s，共30个循环；72℃10min。成熟肽基因序列扩增成功后，再以稀释50倍的上述PCR产物为模板，采用OverlapPCR的方法，使用下述引物，分两步PCR，在mBD2成熟肽基因上游加入鼠IgΚ分泌性信号肽基因序列(5′ATGGAGTCAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGG

6、TTCCAGGTTCCACTGGTGAC3′)。上游引物1：5′CTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGAACTTGACCACTGCCACACC3′；上游引物2(框内部分为BamHⅠ酶切位点)：5′CGGGATCCATGGAGTCAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCC3′；下游引物(框内部分为XbaⅠ酶切位点)：5′GCTCTAGATTATCATTTCATGTACTTGCAAC3′。两步PCR扩增片段长度分别为161bp和202bp，反应条件分别为：第一步PC

7、R:94℃2min；94℃1min，56℃1min，72℃40s，共30个循环；72℃10min。第二步PCR：94℃2min；94℃1min，58℃1min，72℃40s，共30个循环；72℃10min。同时设立小鼠βactin基因作为内参照,其引物序列为上游引物：5′ATGGATGACGATATCGCTGCGCTGG3′，下游引物：5′TCTTTGATGTCACGCACGATTTCCC3′。扩增片段641bp。　　1.2.3mBD2真核表达载体的构建与鉴定　　对第三步202bp的PCR产物TA克隆后，将含有IgКmBD2的pMD2

8、0T载体和pcDNA3.1(+)载体分别采用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收IgΚmBD2目的片段和酶切