人epo基因真核表达载体的构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达的论文

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1、人EPO基因真核表达载体的构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达的论文作者：夏桂枝，张国成，陈新民，洪新如【摘要】　　目的：构建人epo基因真核表达载体并转染人脐血间充质干细胞，获得稳定表达人epo的人脐血间充质干细胞.方法：从人胎肝细胞中提取总rna，经过rtpcr方法扩增人epo全长cdna，应用基因重组技术将epocdna基因亚克隆至pcdna3真核表达载体内，以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcdna3-epo构建的正确性，再将pcdna3-epo经脂质体介导转染人脐血间充质干细胞，经g418筛选后获得稳定转染epo基因的人脐血间充质干细胞，用rt-pcr，:toconstructth

2、eeukaryoticexpressionvectorofhumanepogeneandexploreitsexpressioninmesenchymalstemcells(mscs)derivedfromhumanumbilicalcordblood(ucb).methods:thetotalrnahumanfetallivercells.epocdnaplicationandsubclonedintopcdna3vectortoconstructrebinantpcdna3-epoplasmid.afteridentifiedbyrestrictionenzymeanalysisan

3、dsequencing,thepcdna3-epoanucb-derivedmscsmediatedbylipofectamineandtheexpressionofexogenousepoinedbyrt-pcr,munocytochemistry.results:therebinantpcdna3-epoeetthedesignbyrestrictionenzymeanalysisandsequencing.theresultsofrt-pcr,munocytochemicalanalysesindicatedthattheexogenouseposuccessfullyexpres

4、sedinhumanucb-derivedmscs.conclusion:therebinantpcdna3-epoanepocdnaissuccessfullyconstructedandhumanucb-derivedmscsesenchymalstemcells;transfection　　0引言　　近年研究发现促红细胞生成素（erythropoietin，epo）具有神经营养、神经保护和促进神经发育的作用，在脑组织损伤尤其是新生儿缺氧缺血性脑损伤中发挥着重要作用［1］.间充质干细胞（mesenchymalstemcells，mscs）是近年发现的一种具有多向分化潜能的成体干细胞［

5、2］，而且是外源基因良好的细胞载体［3-4］.我们构建人epo基因真核表达载体，将其转染人脐血mscs，观察epo在人脐血mscs中的表达情况，以探索epo基因修饰的人脐血mscs用于移植治疗新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemicencephalopathy，hie）的可行性.　　1材料和方法　　1.1材料人胎肝细胞系l02，质粒pcdna3由福州总医院实验科王水良博士惠赠.菌种e.colidh5α为福州总医院实验科保存.rt-pcr反转录试剂盒（promega公司）；dna胶回收试剂盒（上海华尧核酸技术有限公司）；质粒抽提纯化试剂盒（qiagen公司）；ecorⅰ，xh

6、oⅰ限制性内切酶，dntp，taq酶，t4dna连接酶，dna分子质量markerdl2000，dl15000（takara公司）；lipofectamim2000，trizol（invitrogen公司）；mscs培养基mesenculttm（stemcell公司）；兔抗人epo抗体、hrp-羊抗兔igg，plus试剂盒（北京中杉生物技术公司）.　　1.2方法　　1.2.1epocdna的合成参照trizol说明书抽提人胎肝l02细胞总rna，反转录为人胎肝细胞总cdna，以反转录产物为模板，pcr法扩增epocdna.pcr引物根据genbank中登录的epocdna全长序列设计两对

7、引物.扩增epocdna全长序列上游引物：5′-atgaattcatgggggtgcacgaatgtcc-3′，下划线部分为ecorⅰ酶切位点，下游引物：5′-gcctcgagtcatctgtcccctgtcctgc-3′，下划线部分为xhoⅰ酶切位点；预期扩增片段长582bp.rt-pcr法鉴定epo在人脐血mscs中表达的上游引物为：5′-tcatctgtgacagccgagtc-3′，下游引物为：5′-cactgacggctt