vcc1真核表达载体的构建及肝癌细胞smmc7721稳定转染株的建立及鉴定

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1、VCC1真核表达载体的构建及肝癌细胞SMMC7721稳定转染株的建立及鉴定：牟霞,陈瑶,王穗海,黄湘,李明【摘要】　　目的:构建pcDNA3.1(-)/VCC1真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法:以SMMC7721细胞总RNA为模板,通过RTPCR扩增VCC1基因编码区cDNA,并将扩增的cDNA片段与pMD19T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,

2、经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RTPCR及MC7721细胞中并得到表达。结论:成功地建立了人基因VCC1的肝癌细胞SMMC7721稳定转染株,为进一步研究VCC1的功能奠定了基础。【关键词】VCC1;载体构建;转染　　VCC1（VEGFcorrelatedchemokine1）基因是新近发现的一个趋化因子,被命名为VEGF相关的趋化因子1,该基因编码119个氨基酸,含有6个半胱氨酸残基,其中4个分别位于2个CXC结构域中,目前列为CXCL17。研究发现VCC1在乳腺癌、

3、结肠癌中高表达,并与血管形成相关,在肿瘤的发生发展中可能扮演重要角色［1］。为了研究VCC1基因过表达后对肿瘤细胞生物学的影响,我们将VCC1基因克隆构建到真核表达载体上,并稳定转染到SMMC7721肝癌细胞中。　　1材料和方法　　　　1.1材料大肠杆菌DH5α和人肝癌细胞系SMMC7721均由本实验室保存,pMD19T载体购自大连宝生物工程有限公司,MMLV逆转录酶购自Promega公司,各种分子克隆工具酶购自MBI公司,脂质体Lipofectamine2000、TRIzol试剂、G4

4、18和pcDNA3.1(-)真核表达载体购自Invitrogen公司,RPMI1640、胎牛血清(FBS)等购自GibcoBRL公司。　　1.2方法　　1.2.1SMMC7721总RNA的提取按照TRIzol试剂说明书步骤提取总RNA。收集所培养的SMMC7721,加TRIzol试剂1mL,静置3～5min。加入氯仿0.5mL,混匀。室温静置2～3min后,12000r/min离心15min。于上清中加人0.5mL异丙醇,室温静置10min。10000r/min离心10min。弃上清,加入75

5、0mL/L乙醇1mL,7500r/min离心5min,干燥沉淀,加入30μLDEPC处理水。经琼脂糖凝胶电泳显示无降解后,用紫外分光光度计测定其纯度并定量,保存于-80℃备用。　　1.2.2引物设计根据GenBank的基因序列(AY358433),设计扩增VCC1编码区cDNA上、下游引物。上、下游引物中分别引入XhoI、BamHI酶切位点,扩增片段为360bp。上游5′CTCGAGATGAAAGTTCTAATCTCTTCCC3′,下游5′GGATCCCAAAGGCAGAGCAAAG3′

6、;内参照βactin的引物序列为:上游5′TGTGACGTGGACATCCGCAAAG3′,下游5′TGGAAGGTGGACAGCGAGGC3′,扩增片段为206bp。并设计作为转染SMMC7721细胞后鉴定用的G418抗性基因PGKneo的特异性引物:上游5′AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG3′,下游5′AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG3′,扩增片段为492bp。所有引物均由Invitrogen公司合成。　　1.2.3

7、逆转录合成cDNA逆转录反应体系为:细胞总RNA1μg,H2O13μL,oligdT0.5μg,70℃5min,立刻冰上放置,加入MMLV200u,dNTP10nmol,5×MMLVBuffer5μL,RebinantRNasinRibonucleaseInhibitor25u,混匀后42℃1h,70℃10min。取10μL反转录产物进行PCR反应,采用降落PCR(Touchdoin;94℃变性30s,60℃退火90s,72℃延伸40s,随后每个循环退火温度降低0.5℃,其他条件不变,共进行1

8、0个循环。然后:94℃30s,60℃90s,72℃40s扩增20个循环,72℃延伸7min。PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后,切胶回收目的片段。　　1.2.4T载体克隆对PCR产物进行割胶纯化,将目的片段与pMD19T载体连接。连接反应体系为:SolutionI5μL,pMD19TDNA50ng,PCR产物50ng,ddH2O3μL,置于16℃2h后,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态,在氨苄青霉素抗性平板上筛选生长,挑取单克隆菌落。阳性克隆经酶切鉴定,并命名为:pM