重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选

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1、重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选作者：徐腾飞,张文卿,于红,李丹【摘要】　　目的:构建人表皮生长因子受体（HER2）胞外区（1896bp）基因的真核表达质粒（pcDNA6/v5hisHER2）,转染小鼠乳腺癌细胞（EMT6）,获得其稳定表达细胞株(EMT6/HER2)。方法:用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列;经酶切、连接构建pcDNA6/v5hisHER2;转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,对其进行酶切及测序鉴定;以PEI法将pcDNA6/v5hi

2、sHER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选1～2周,获得抗性克隆EMT6/HER2;用RTPCR检测EMT6/HER2中HER2mRNA,免疫组化法检测其HER2蛋白的表达。结果:PCR产物与预期片段大小一致;pcDNA6/v5hisHER2经酶切、琼脂糖凝胶电泳后,可见与PCR产物大小相同的片段;DNA测序结果显示,pcDNA6/v5hisHER2中HER2基因序列无误,读码框正确;用RTPCR可在EMT6/HER2中检测到HER2mRNA,免疫组化法证实,EMT6/HER2中有HER2的阳性信

3、号。结论:成功地构建了HER2胞外区真核表达载体,获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株,为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础。12【关键词】HER2;真核表达;转染　　［Abstract］AIM:Toconstructaneukaryoticvectorencodingextracellulardomainofhumanepidermalgrowthfactorreceptors(HER2),pcDNA6/v5hisHER2,andtoscreenHER2positiveclonesfrommous

4、ebreastcancercelllineEMT6.METHODS:TheextracellulardomainofHER2wasamplifiedfrompcDNA3.1HER2byPCR.pcDNA6/v5hisHER2waspreparedbyinsertingthefragmentintotheplasmidpcDNA6/v5his.Thentherecombinantvectorwasidentifiedbyrestrictionenzymeandsequencing.Next,pcDNA6/v5hisHER2wastrans

5、fectedintotheEMT6celllineandthepositiveclones(EMT6/HER2)werescreenedwithblasticidin.Finally,theexpressionofHER2inEMT6/HER2wasdetectedbyRTPCRandimmunohistochemistry.RESULTS:ThefragmentofHER2wasamplifiedandpcDNA6/v5hisHER2waspreparedsuccessfully.Noerrorswerefoundbothinthesequ

6、enceandORFoftheacquiredfragment.TheexpectedfragmentofHER2(1896bp)wasamplifiedfromEMT6/HER2byRTPCRandpositivesignalsofHER2weredetectedinEMT6/HER2byimmunohistochemistry.CONCLUSION:AneukaryoticplasmidencodingHER2(pcDNA6/v5hisHER2)hasbeenconstructedandacelllineexpressingHER2sta

7、blyhasbeenpreparedsuccessfully.12　　［Keywords］HER2;eukaryoticexpression;transfection　　人表皮生长因子受体(humanepidermalgrowthfactorreceptors,HER2)属于表皮细胞生长因子受体(EGFR)家族成员,是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的单链跨膜糖蛋白,相对分子质量(Mr)为185000。HER2作为跨膜蛋白,由胞外结构域(ECD)、跨膜结构域和胞内结构域(ICD)三部分组成。ECD主要是由两个配体结合区(RLD)与两个富含半胱氨酸区构成［

8、1］。HER2RLD可与EGFR受体家族的其他成员及配体形成复合物,参与细胞增殖信号的转导［2］。HER2基因主要是在人体