MiRNA-491—5p慢病毒过表达载体构建及其稳定表达细胞株的筛选-论文.pdf

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1、南通大学学报(医学版)JournalofNantongUniversity(MedicalSciences)2014：34(3·163·MiRNA一491—5p慢病毒过表达载体构建及其稳定表达细胞株的筛选杨诗悦，肖娟娟，赵敦梅，卢慧敏，郑亚标，张苹，王建国，沈方圆，樊丽霞，王静婷，张敏，王明华f苏州大学基础医学与生物科学学院．苏州215123)【摘要]目的：构建miRNA一491—5p慢病毒过表达载体，筛选miRNA一491—5p稳定表达细胞株。方法：构建PCDH一511B—miRNA一491—5p载体，转染HEK293T细胞，通过实时荧光定

2、量PCR检测miRNA一491—5p的含量。结果：实时荧光定量PCR检测显示转染慢病毒载体组miRNA一491—59表达水平是对照载体组的1000倍．证明目的基因已在转染细胞中成功表达。结论：成功构建了miRNA一491—5p慢病毒过表达载体和筛选出了miRNA一491—5p稳定表达细胞株。[关键词]MiRNA一491—5p；实时荧光定量聚合酶链反应；慢病毒；载体[中图分类号]Q782【文献标志码】A[文章编号]1674—7887(2014)03—0163—04Constructionoflentivirusexpressionvectoro

3、fmiRNA-491-5pandscreeningofcelllinesforstableexpressionofmiRNA一491—5pYANGShiyue，XIA0Juanjuan，ZHA0Dl~nmei，LUHuimin，ZHENGYabiao，ZHANG，WANGJianguo，SHENFangyuan，NLixia，WANGJingting，ZHANGMin，WANGMinghua(SchoolofBasicMedicalandBiologicalSciences，SoochowUniversity，Suzhou215123)【Ab

4、stract】Objective：ToconstructthelentivirusexpressionvectorofmiRNA一491—5pandtoscreencelllinesforstableexpressionofmiRNA一491—5p．Methods：TheconstructedrecombinantvectorwastransfectedtoHEK293Tcel1．ThemiRNA-491-5pexpressionwasdetectedbyusingreal-timequantitativepolymerasechainrea

5、ctionfPCR1．Results：Real—timequantitativepolymerasechainreactionshowedthattheover—expressionofmiRNA一491—5pofvirusvectorwas1000timesofthatofcontrolvectorgroup，whichindicatedthatgoalgenewasexpressedintransfectedcellssuccessfully．Conclusion：Theover——expressionvirusvectorofmiRNA

6、—-491——5phavebeensuccessfullyconstructedandacelllinesforstableexpressionofmiRNA一491—5phavebeensuccessfullyscreened．【Keywords】miRNA一491—5p；real—timequantitativepolymerasechainreaction；lentivirus；vectorMicroRNA(miRNA)是广泛存在于真核生物中的用l7】。MiRNA一491—5p在胃癌细胞中具体的作用机制一类具有调控功能的非编码RNA，通

7、过互补或不完还不明了。为了继续进行其功能研究，本研究拟构建全互补的方式识别并结合靶基因引导沉默复合体，miRNA一491—5D的慢病毒过表达载体，转染使靶基因mRNA降解或调控其蛋白翻译[1-21，从而在HEK293T细胞，应用实时荧光定量PCR检测转染细转录后水平影响基因和f或1蛋白的表达_3l。近年来研胞中miRNA一491—5D的表达量，以判断慢病毒载体究证实，miRNA的调节紊乱与一些肿瘤的发生密过表达miRNA一491—5D的程度。接着将其包装成病切相关，并且许多miRNAs调控位点位于与细胞癌毒颗粒，进一步感染胃癌AGS细胞，筛选

8、miRNA一变密切相关的细胞周期调控因子基因、癌基因或抑491—5D稳定表达细胞株。癌基因上，这对于癌症病因学的研究具有重要意义。1材料与方法我们将Ambion公司